čištění a charakterizace asparaginázy ze semen Phaseolus vulgaris

Abstrakt

L-asparagináza z bakterií byla použita při léčbě akutní lymfoblastické leukémie. Cílem této studie bylo vyčistit a charakterizovat L-asparaginázu ze semen Phaseolus vulgaris místo mikrobiálních zdrojů. L-asparagináza byla purifikována do zdánlivé homogenity. Enzym má molekulovou hmotnost 79 kDa. Purifikovaná asparagináza měla velmi nízkou aktivitu vůči řadě analogů asparaginu a glutaminu. L-asparagináza byla prostá aktivity glutaminázy. Bylo zjištěno, že kinetické parametry, Km a Vmax purifikovaného enzymu, jsou 6,72 mM a 0,16 µM. Enzym měl optimální pH při 8,0. Enzym vykazoval vysokou stabilitu při alkalickém pH (pH 7,5-9,0), když byl inkubován po dobu až 24 hodin. L-asparagináza měla stejnou teplotní optimální a tepelnou stabilitu při 37°C. K+ byl schopen výrazně zvýšit aktivitu asparaginázy o 150% ve srovnání s jinými testovanými kovy. Závěrem lze říci, že L-asparagináza nevykazovala žádnou aktivitu glutaminázy a dobrou stabilitu v širokém spektru fyziologických stavů, a proto by mohla být použita jako potenciální kandidát pro léčbu akutní lymfoblastické leukémie.

1. Úvod

L-asparagináza (l-asparagin amidohydrolase E. C. 3. 5. 1. 1) se používá při léčbě akutní lymfoblastické leukémie a non-Hodgkinova lymfomu . Použití L-asparaginázy v protinádorové terapii je založeno na její schopnosti štěpit L-asparagin, aminokyselinu nezbytnou pro růst lymfoblastů, na amoniak a kyselinu L-asparagovou v séru a mozkomíšním moku, protože lymfoblasty nejsou schopny produkovat endogenní l-asparagin, což vede ke smrti těchto buněk . Většina rakovinných buněk je závislá na exogenním zdroji této aminokyseliny pro přežití. Normální buňky jsou však schopny syntetizovat L-asparagin, a proto jsou méně ovlivněny jeho rychlým vyčerpáním v důsledku léčby tímto enzymem. L-asparagináza může být také použita ke snížení tvorby akrylamidu v smažených a vařených potravinách, zejména v bramborových lupíncích . Tvorba akrylamidu byla přičítána reakci volného asparaginu a redukujících cukrů . Deplece asparaginu asparaginázou zabránila tvorbě akrylamidu .

L-asparagináza je široce distribuována mezi rostlinami, zvířaty a mikroorganismy . V rostlině byl tento enzym poprvé detekován u vyvíjejících se semen Lupinus albus . Asparagináza byla také purifikována z testa zrajících semen l. polyphyllus . Byly identifikovány dvě formy enzymu. K + – nezávislá forma se nachází v L. arboreus a L. polyphyllus a K + – dependentní forma se nachází v Pisum sativum a několika dalších druhů luštěnin, včetně jiných druhů Lupinus. Práce s protilátkami proti formě nezávislé na K+Z L. polyphyllus neodhalila žádnou zkříženou reakci s asparaginázou hrachu ani s řadou odrůd Lupinus obsahujících enzym závislý na K+, což naznačuje, že obě formy asparaginázy jsou imunologicky odlišné .

bylo hlášeno velmi málo informací o použití rostlinné asparaginázy při léčbě akutní lymfoblastické leukémie . Hlavním cílem této studie proto bylo vyčistit a charakterizovat L-asparaginázu ze semen Phaseolus vulgaris bez L-glutaminázy místo L-asparaginázy z mikrobiálních zdrojů, který se používá jako protinádorový a způsoboval vedlejší účinky v důsledku jeho imunologických odpovědí.

2. Materiál a metody

2.1. Rostlinné materiály

zralá semena z Phaseolus vulgaris cv. Gíza 6 byly získány ze zemědělského výzkumného střediska, Káhira, Egypt.

2.2. Čištění asparaginázy

2.2.1. Surový extrakt

surový extrakt asparaginázy byl připraven homogenizací 50 g semen z Phaseolus vulgaris cv. Giza 6 v 20 mM Tris-HCl pufru, pH 8,0 obsahující 10% glycerolu, 50 mM KCl, 12,5 mM β-merkaptoethanolu a 1 mM PMSF. Homogenát byl centrifugován při 10 000 ×g a supernatant byl označen jako surový extrakt. Surový extrakt byl koncentrován dialýzou proti pevné sacharóze.

2.2.2. Kolona DEAE-Sefarosy

koncentrovaný surový extrakt byl aplikován na kolonu DEAE-Sefarosy (15 × 1,6 cm i.d.), která byla předtím vyrovnána s 20 mM Tris-HCl pufrem, pH 8,0. Enzym byl eluován různými koncentracemi KCl připravených ve stejném pufru při průtoku 60 mL / h a byly odebrány 3 mL frakce. Tři píky proteinu byly eluovány aktivitou asparaginázy podle pořadí elukce (asparaginázy I ,II a III).

2.2.3. Sefakryl S-200

asparagináza I s nejvyšší aktivitou byla aplikována na kolonu Sefakryl S-200 (90 × 0.6 cm i.d.), který byl předtím vyrovnán stejným pufrem při průtoku 30 mL / h a byly odebrány 3 mL frakce.

2.3. Test asparaginázy

aktivita L-asparaginázy byla měřena modifikovanou metodou zápěstí . L-asparagináza katalyzuje L-asparagin na kyselinu L-asparagovou a amoniak a ty reagují s Nesslerovým činidlem za vzniku oranžově zbarveného produktu. Enzymová testovací směs sestávala z 900 µL čerstvě připraveného l-asparaginu (20 mM) v 50 mM Tris-HCl pufru (pH 8,0), 50 mM KCl a 100 µL surového extraktu enzymu. Reakční směs byla inkubována při 37°C po dobu 30 minut a reakce byla zastavena přidáním 100 µL 15% kyseliny trichloroctové. Reakční směs se odstředí při 10 000 ×g po dobu 5 minut při 4°C, aby se odstranily sraženiny. Amoniak uvolněný v supernatantu byl stanoven kolorimetrickou technikou přidáním 100 µL nesslerova činidla do vzorku obsahujícího 100 µL supernatantu a 800 µL destilované vody. Obsah vzorku byl vortexován a inkubován při pokojové teplotě po dobu 10 minut a OD byl měřen při 425 nm. Amoniak vzniklý při reakci byl stanoven na základě standardní křivky získané síranem amonným. Jedna jednotka aktivity l-asparaginázy je definována jako množství enzymu, které uvolňuje 1 µmol amoniaku za minutu při 37°C.

2.4. Stanovení proteinu

Protein byl kvantifikován metodou Bradfordu s bovinním sérovým albuminem jako standard.

2.5. Stanovení molekulové hmotnosti

nativní molekulová hmotnost byla stanovena Sefakrylem S-200. Kolona byla kalibrována cytochromem C (12 400), karboanhydrázou (29 000), bovinním sérovým albuminem (67 000), alkoholdehydrogenázou (150 000) a β-amylázou (200 000). Dextranová modř (2 000 000) byla použita k určení objemu prázdnoty (Vo). Molekulová hmotnost podjednotky byla odhadnuta elektroforézou SDS-polyakrylamidového gelu . SDS-denaturovaná fosforyláza b (94 000), bovinní sérový albumin (67 000), ovalbumin (43 000), karboanhydráza (30 000), inhibitor trypsinu sóji (20 000) a α-laktalbumin (14 200) byly použity pro kalibrační křivku.

2.6. Charakterizace asparaginázy

2.6.1. Specificita substrátu

aktivita asparaginázy byla stanovena s některými analogy L-asparaginu. Relativní aktivita byla vyjádřena jako procentní poměr enzymové aktivity stanovený proti různým strukturním analogům L-asparaginu k enzymové aktivitě S L-asparaginem.

2.6.2. Kinetické parametry

hodnoty Michaelisových konstant (Km) a maximální rychlosti (Vmax) byly stanoveny pomocí l-asparaginu jako substrátu v rozmezí 2-20 mM. kinetické parametry byly stanoveny z Lineweaver-Burkova grafu.

2.6.3. Účinek pH

optimální pH pro aktivitu asparaginázy bylo stanoveno stanovením aktivity při různých hodnotách pH. Stabilita pH byla testována inkubací enzymu při pH 5,0-9,0 po dobu 24 h při 4°C v nepřítomnosti substrátu a zbytková aktivita byla stanovena za standardních podmínek testu.

2.6.4. Vliv teploty

optimální teplota pro aktivitu asparaginázy byla stanovena stanovením enzymu při různých teplotách. Tepelná stabilita byla měřena inkubací samotného enzymu při různých teplotách po dobu 1 hodiny. po tepelném zpracování byl roztok enzymu ochlazen a zbytková aktivita byla testována po přidání substrátů.

2.6.5. Účinek kovových iontů

účinky různých kovových iontů na enzymovou aktivitu byly stanoveny předinkubací samotného enzymu 10 mM kovovými ionty po dobu 15 minut před přidáním substrátu. Aktivita, která byla testována v nepřítomnosti kovových iontů, byla považována za 100%.

3. Výsledky a diskuse

výsledky purifikačních kroků asparaginázy z P. vulgaris jsou shrnuty v tabulce 1. Eluční profil chromatografie na koloně DEAE-Sepharose (Obrázek 1) vykazoval tři píky proteinů s aktivitou asparaginázy. První vrchol s nejvyšší aktivitou asparaginázy byl aplikován na kolonu Sefakrylu S-200 (Obrázek 2). L-asparagináza I byla purifikována 21,7 krát se specifickou aktivitou 846 jednotek/mg proteinu. Asparagináza I byla prokázána jako čistá po koloně sefakryl S-200, jak bylo hodnoceno pomocí SDS-PAGE (obrázek 3). Molekulová hmotnost asparaginázy I postupy Sefakrylu S-200 a SDS-PAGE poskytla hodnotu 79 kDa jako monomerní podjednotku. Toto zjištění je v souladu s molekulovou hmotností pro asparaginázy z Vigna unguiculata (70 kDa) a Lupinus polyphyllus (75 kDa). Byla zjištěna střední molekulová hmotnost 58 kDa pro asparaginázu z listů hrachu . U bakteriálních asparagináz se molekulová hmotnost pohybovala od 140 do 160 kDa s tetramerovými podjednotkami . Pro Streptobacillus sp byla zjištěna velmi nízká molekulová hmotnost 11,2 kDa. Kk2s4 asparagináza .

Obrázek 1

typický eluční profil pro chromatografii asparaginázy z P. vulgaris na koloně DEAE-Sepharose (15 × 1,6 cm i.d.) dříve vyrovnaný s 20 mM Tris-HCl pufrem, pH 8,0 při průtoku 60 mL / h a 3 mL frakcí.

Obrázek 2

gelová filtrace asparaginázy I z deae-sefarosové frakce na koloně sefakryl S-200 (90 × 1,6 cm i.d.). Kolona byla vyrovnána 20 mM Tris-HCl pufrem, pH 8,0 při průtoku 30 mL/h a 3 mL frakcích.

obrázek 3

SDS-PAGE pro homogenitu a stanovení molekulové hmotnosti asparaginázy I z Phaseolus vulgaris. (1) proteinové markery; (2) sefakryl s-200 asparagináza i.

substrátová specificita asparaginázy I byla zkoumána za použití řady analogů asparaginu a glutaminu (Tabulka 2). Aktivita S L-asparaginem byla považována za 100% aktivitu. DL-asparagin vykazoval 30% enzymové aktivity, kde DL-asparagin je složen z 1 : 1 racemická směs. D-asparagin, kyselina L-asparagová a analogy kyseliny L-glutamové měly velmi nízkou aktivitu vůči asparagináze i. v přítomnosti L-glutaminu nebyla zjištěna žádná aktivita. Proto asparagináza i z P. vulgaris neobsahuje glutaminázu. Kontaminace asparaginázy aktivitou glutaminázy způsobila vedlejší účinky v průběhu protinádorové léčby . Asparagináza L. arboreus hydrolyzovala pouze L-asparagin a DL-aspartylhydroxamát . Asparagináza v. unguiculata byla specifická pro L-asparagin, hydrolyzovala D-asparagin a nebyla specifická pro L-glutamin .

bylo zjištěno, že kinetické parametry, Km a Vmax purifikovaného enzymu, jsou 6,72 mM asparaginu a 0,16 µM amoniaku / mL (Obrázek 4). Podobné hodnoty Km 6,6 a 7,0 mM byly stanoveny pro asparaginázy z L. arboreus a L .angustifolius. Asparagináza ze semen lupinu má vysoký podíl asparaginu (12,2 mM) . Nízký Km (1.2 mM) byla stanovena pro asparaginázu z V. unguiculata . U bakterií byly hodnoty Km Pro L-asparaginázu z Escherichia coli a Erwinia carotovora 3, 5 a 7, 14 mM .

obrázek 4

Lineweaver-Burkův graf týkající se asparaginázy I od rychlosti P. vulgaris k různým koncentracím l-asparaginu.

asparagináza i vykazovala pH optimum při 8,0 (obrázek 5). Mezi pH 6,0 a 9,0 bylo zachováno více než 50% jeho aktivity. Ačkoli maximální aktivita při fyziologickém pH je jedním z předpokladů L-asparaginázy pro protinádorovou aktivitu, purifikovaný enzym by byl užitečný, protože 80% enzymové aktivity bylo zachováno při pH 7,5. Enzym vykazoval stabilitu při alkalickém pH (pH 7,5–9,0), protože si po inkubaci do 24 hodin zachoval 90% své původní aktivity (obrázek 6). PH optimum L-asparagináz z několika rostlin se však pohybovalo od 8,0 do 8,5 . Většina L-asparagináz z bakterií vykazovala alkalické pH optima (8,0-10) .

obrázek 5

pH optimum asparaginázy I z P. vulgaris. Aktivita enzymu byla měřena při různých pH pomocí standardní metody stanovení, jak bylo popsáno výše.

obrázek 6

stabilita pH asparaginázy I z P. vulgaris při různém pH po inkubaci po dobu 24 hodin při 4°C.

bylo zjištěno, že asparagináza I má optimální teplotu při 37°C (Obrázek 7). Podobné teplotní optimum asparaginázy z V. unguiculata (40°C) bylo hlášeno . Tato teplota byla také podobná teplotě hlášené pro Pseudomonas aeruginosa a Pectobacterium karotovorum . Optimální aktivita Streptobacillus sp. asparagináza byla zaznamenána při 35°C . Naopak, l-asparagináza z Chrombacteriaceae a Proteus vulgaris byla pozorována při 20°C a 57°C . Byl zjištěn nelineární vztah mezi asparaginázou I a teplotní stabilitou (Obrázek 8). Aktivita enzymu byla stabilní až do 37°C po inkubaci po dobu 1 hodiny. asparagináza Z V. unguiculata byla stabilní až do 40°C po inkubaci po dobu 15 minut . Asparaginázy z P. carotovorum a C. annuum si zachovaly svou počáteční aktivitu po inkubaci při 40°C a 45°C po dobu 60 minut .

Obrázek 7

teplotní optimum asparaginázy I z P. vulgaris. Aktivita enzymu byla měřena při různých teplotách za použití standardní metody stanovení, jak bylo popsáno výše.

Obrázek 8

tepelná stabilita asparaginázy I z P. vulgaris. Reakční směs se před přidáním substrátu předinkubovala při různých teplotách po dobu 60 minut a následovalo ochlazení v ledové lázni. Aktivita enzymu byla měřena standardní metodou, jak bylo popsáno výše. Aktivita v nulovém čase byla považována za 100% aktivitu.

byl zkoumán vliv různých kovových iontů na asparaginázu I (tabulka 3). Kovové ionty byly použity v koncentraci 10 mM. K+ byl schopen výrazně zvýšit aktivitu asparaginázy I o 150%. V rostlině byly identifikovány asparaginázy nezávislé na K+a k+. K + působil také jako enhancer na asparaginázu P .carotovorum. Ca2 + mírně zvýšil aktivitu o 110%, ale Cu2 + mírně inhiboval aktivitu asparaginázy i. kromě toho PB2+ a Hg2+ způsobily částečně inhibiční účinek na asparaginázu i. avšak v. unguiculata asparagináza byla aktivována Ni2+ a Co2+ a byla inhibována Mn2+, Zn2+, Ba2+ a Hg2+. EDTA jako kovové chelatační činidlo způsobilo částečně inhibiční účinek na asparaginázu i. EDTA však neměla žádný účinek na asparaginázu P. carotovorum .

4. Závěry

L-asparagináza i z P. vulgaris byla purifikována ve formě bez glutaminázy, což může snížit možnost nežádoucích účinků v průběhu protinádorové léčby. Enzym vykazoval dobrou stabilitu v širokém spektru fyziologických podmínek, jako je pH a teplota. V dalším kroku našeho projektu bude L-asparagináza i od P. vulgaris použita jako potenciální kandidát na léčbu akutní lymfoblastické leukémie.

střet zájmů

autoři nemají žádný střet zájmů relevantní pro tento dokument zveřejnit.

poděkování

tento projekt byl financován z Národního plánu pro vědu, technologii a inovace (MAARIFAH), King Abdulaziz City for Science and Technology, Saúdská Arábie, award no. (11-BIO-1516-03). Autoři také s poděkováním uznávají vědeckou a technologickou jednotku King Abdulaziz University za technickou podporu.