pomocí techniky DBE jsme systematicky odebírali biopsie z celého lidského střevního traktu a charakterizovali distribuci enteroendokrinních k A L buněk a expresi jejich hormonálních produktů u zdravých jedinců a jedinců s diabetem 2.typu.
protože diabetes typu 2 znamená nadváhu/obezitu a dysfunkční homeostázu glukózy, která by mohla korelovat se změnami v enteroendokrinních k A L buňkách, byla studie navržena tak, aby popsala distribuční vzorec těchto buněk a expresi některých jejich produktů ve dvou prospektivně přijatých, podobně velkých, dobře definovaných a odpovídajících skupinách dobrovolníků bez známých gastrointestinálních poruch. Pomocí DBE bylo možné získat vysoký počet vzorků v celém střevním traktu: z devíti anatomicky specifických oblastí (obr. 1) a 7-22 „stanic“ podél jejuna a ilea. Biopsie z anatomicky dobře definovaných oblastí byly vysoce srovnatelné. Větší nejistota existuje ohledně umístění biopsie v jejunu a proximálním ileu (umístění biopsie 3-9, obr. 1) Vzhledem k proměnlivé délce intubace a tím i počtu vzorků získaných mezi jednotlivci. K řešení tohoto problému jsme systematicky rozdělili jejunum a ileum do sedmi oblastí(viz metody). Submukózní inkoustová značka umístěná v maximální hloubce vložení během anterográdní enteroskopie byla pozorována během retrográdní enteroskopie u čtyř z 24 jedinců, což naznačuje celkovou enteroskopii(obr. 2). Předpokládá se, že většina střevního traktu byla zkoumána u ostatních účastníků podle délky dosažené intubace (podrobnosti viz náš metodický dokument ).
použili jsme imunohistochemii a počet buněk ke kvantifikaci enteroendokrinních buněk a enzymů zpracovávajících prohormony a analýzu exprese mRNA qPCR k vyhodnocení hormonálních / enzymatických produktů. Obě metody jsou dobře zavedené, ale také představují omezení. Vysoká specificita protilátek používaných v imunohistochemii má velký význam pro zajištění minimálního nespecifického barvení(falešně pozitivních). Proto jsme vybrali protilátky, které jsou dobře zavedené a dobře charakterizované . Pomocí imunohistochemie a počtu buněk z mikrofotografií krájených biopsií jsou trojrozměrné objekty (tj. Optimálnější technikou pro hodnocení buněčné distribuce by byla stereologie, ve které se odhaduje skutečná hustota (tj. Tato technika by však vyžadovala úplné příčné „bloky“ tkáně, což je neslučitelné s vysokým počtem míst biopsie, a tedy podrobné mapování střevního traktu u živých lidí, na které bylo v této studii zaměřeno. Dále je třeba vzít v úvahu následující skutečnosti. Za prvé, hodnocení exprese mRNA indikuje aktivitu endokrinních buněk, ale neposkytuje měřítko celkové produkce určitého buněčného produktu, protože ne všechny mRNA jsou přeloženy do konečného aktivního produktu. Za druhé, exprese je relativní, protože specifické transkripty mRNA souvisejí s expresí stabilně exprimovaného genu (další podrobnosti viz metody ESM). Vzhledem k biologické heterogenitě diabetu 2. typu mohly být potenciálně zjištěny výraznější rozdíly s větší velikostí vzorku a zahrnutím pacientů s rozsáhlejší dysregulací glukózy.
práce Sjölund et al z roku 1983 o distribuci enteroendokrinních buněk je dosud nejpodrobnější provedená v lidském střevě pomocí IHS se širokou škálou antisér (25 typů) proti známým nebo navrhovaným střevním neurohormonálním peptidům . V té době nebyly k dispozici minimálně invazivní techniky. V souladu s tím byly vzorky odebrány pouze ze sedmi oblastí: proximální a distální dvanáctník, střední jejunum, distální ileum, vzestupné tlusté střevo, distální část příčného tlustého střeva nebo sigmoidního tlustého střeva a konečníku. Pro každou oblast byl tkáňový materiál získán od 9-17 jedinců. Vzorky byly odebrány buď během operace břicha (primárně prováděná z důvodu malignity) nebo během enteroskopických vyšetření zahrnujících biopsie u jedinců s „jinými gastrointestinálními poruchami“, včetně řady nespecifikovaných příznaků a onemocnění(např. „okultní krvácení“ a „onemocnění jater“). V roce 1985 Adrian et al použil techniku radioimunoanalýzy ke stanovení množství PYY v žaludečním fundusu a antru, dvanáctníku, jejunu, ileu, vzestupném tlustém střevě, sigmoidním tlustém střevě a konečníku . Vzorky z každého místa byly získány od 5-8 jedinců podstupujících chirurgický zákrok v důsledku karcinomu nebo žaludečních vředů. V roce 1992 byla eissele et al hlášena studie zkoumající distribuci enteroendokrinních l buněk u lidí . Vzorky byly získány ze sedmi oblastí: duodenum, proximální a distální jejunum, ileum, vzestupné tlusté střevo, příčné tlusté střevo a konečník. Vzorky byly získány pouze od pěti účastníků, kteří podstoupili operaci karcinomu nebo Crohnovy choroby. V roce 2005 Guedes et al zkoumali distribuci GIP -, GLP – 1-a CGA-pozitivních buněk pomocí IHS na vzorcích z každých 20 cm tenkého střeva u 30 lidských mrtvol .
je třeba zdůraznit, že čtyři výše uvedené studie zkoumaly normálně se objevující vzorky tkání bez známek patologických změn. Přítomnost maligních nebo zánětlivých změn ve střevní oblasti nebo rychlé zahájení degradace buněk po porážce však mohly ovlivnit obecnou distribuci a funkci enteroendokrinních buněk. Výsledky navíc mohla ovlivnit heterogenita účastníků.
v souladu s našimi výsledky popsali Sjölund et al, Eissele et al, Adrian et al A Guedes et al, respektive, variace produktů L buněk (GLP-1 a/nebo PYY) v závislosti na lokalizaci střeva, s vyšší hustotou/množstvím v distálním jejunu a ileu ve srovnání s dvanáctníkem a proximálním jejunem a zvyšující se hustotou / množstvím od proximálního k distálnímu tlustému střevu, s nejvyššími hladinami v konečníku . Naše výsledky podporují tento vzorec distribuce l buněk u zdravých jedinců a u diabetu 2. typu, se zvyšující se expresí genu GCG a PYY, stejně jako se zvyšující se hustotou GLP-1 a PYY-pozitivních buněk, podél tenkého střeva a podél tlustého střeva. Také jsme pozorovali největší signál markerů l buněk (PYY-a GLP-1-pozitivních buněk a exprese PYY mRNA) v konečníku, s výjimkou exprese GCG. Důsledky—pokud existují-pozorovaných rozdílů mezi skupinami (významně větší exprese GCG a PYY v tlustém střevě účastníků s diabetem typu 2 ve srovnání se zdravými jedinci)nejsou v současné době známy. Je dobře prokázáno, že inkretinový účinek je snížen u diabetu 2.typu a bylo navrženo, že defekt v sekreci GLP-1 vyvolané živinami může přispět k vysvětlení tohoto jevu. Studie zkoumající odpovědi GLP-1 na podněty živin u pacientů s diabetem typu 2 a nediabetických jedinců však ukázaly, že obecně jedinci s diabetem typu 2 nevykazují sníženou plazmatickou celkovou odpověď GLP-1.
Pozorovali jsme rozpor mezi hladinami exprese GCG a hustotou buněk pozitivních na GLP-1 podél střeva. To zdůrazňuje, že L buňky v jedné části tenkého střeva se mohou chovat odlišně od enteroendokrinních l buněk v jiné části tenkého střeva, jak navrhl Svendsen et al, kteří pozorovali, že sekrece l buněk se mění podél gastrointestinálního traktu u potkanů, tj. že L buňky vylučují různé poměry PYY a GLP-1, přičemž některé vylučují pouze GLP-1 . V souladu s těmito zjištěními je pravděpodobné, že distálně umístěné l buňky exprimují proglukagon ve vyšší míře než proximálně umístěné l buňky.
naše nálezy větší exprese GIP a hustoty GIP-pozitivních buněk v proximální části tenkého střeva, které se distálně snižují do ileocekální oblasti u zdravých jedinců a pacientů s diabetem 2. typu, jsou v souladu s předchozími nálezy . Na rozdíl od Sjölund et al, kteří zjistili, že GIP-pozitivní buňky chybí v tlustém střevě, jsme byli schopni detekovat nízké hladiny GIP-pozitivních buněk v distální části střevního traktu. Nemůžeme však vyloučit, že je to výsledek nespecifické vazby protilátek. Pozorovali jsme však mRNA expresi GIP v tlustém střevě obou skupin, i když na velmi nízkých úrovních. Exprese GIP byla významně větší u jedinců s diabetem typu 2 v celém střevním traktu. Lze předpokládat, že transkripce GIP je zvýšena jako kompenzační výsledek rezistence GIP, tj. snížený inzulinotropní účinek GIP pozorovaný u jedinců s diabetem 2 .typu. V souladu s tím bylo prokázáno, že hladiny GIP nalačno jsou vyšší u účastníků s diabetem typu 2 ve srovnání s účastníky bez diabetické kontroly, a navíc bylo navrženo, že GIP přispívá k hyperglykémii pozorované u diabetu typu 2 (primárně kvůli glukagonotropnímu účinku GIP). Údaje týkající se GIP odpovědí po perorálním podání glukózy nebo smíšených jídel u jedinců s diabetem typu 2 však byly nekonzistentní a systematický přehled s metaanalýzou naznačuje, že postprandiální GIP odpovědi jsou podobné u pacientů s diabetem typu 2 a zdravými jedinci .
vzhledem k tomu, že kyselý glykoprotein CgA je součástí buněčných váčků a má se za to, že hraje více rolí v sekrečním procesu endokrinních produktů, používá se jako obecný marker enteroendokrinních buněk . Na rozdíl od Guedes et al, kteří pozorovali konstantní hustotu CGA-pozitivních buněk podél tenkého střeva, naše studie ukázala významný pokles. Dále jsme pozorovali větší hustotu CGA pozitivních buněk v tenkém střevě zdravých jedinců než účastníci s diabetem 2. typu. Dalo by se spekulovat, že celkový počet buněk pozitivních na CgA (enteroendokrinní buňky) se u diabetu 2.typu mění—buď v důsledku diabetického stavu 2. typu, nebo možná přispívá k patogenezi diabetu 2. typu. Pozorovali jsme poměrně vysoký počet CGA-pozitivních buněk v konečníku obou skupin. Nedávno Engelstoft et al ukázal na myších, že CgA byla lokalizována hlavně na enteroendokrinní buňky vylučující monoamin a řídce na enteroendokrinní buňky vylučující peptid, možná podporující návrh Sjölunda et al, že rektální enteroendokrinní buňky by mohly mít spíše lokální (parakrinní) funkci než systémovou funkci .
protože je známo, že PC1/3 zpracovává prohormony vedoucí k tvorbě GIP a GLP-1, očekávali jsme přítomnost PC1 / 3 podél celého střevního traktu. Respektive jsme pozorovali rozpor zahrnující větší expresi PCSK1 / 3 a nižší hustoty PC1 / 3-pozitivních buněk v tenkém střevě účastníků s diabetem typu 2 ve srovnání se zdravými účastníky. Jak je uvedeno výše, toto zjištění by mělo být interpretováno s ohledem na to, že některé enteroendokrinní buňky mohou být v některých oblastech velmi aktivní a v jiných oblastech mají nízkou aktivitu.
vzhledem k tomu, že PC2 je primárně známý pro zpracování proglukagonu na glukagon v pankreatických alfa buňkách, bylo zajímavé najít mRNA expresi PCSK2 a PC2-pozitivních buněk podél celého střevního traktu. To by mohlo naznačovat, že glukagon je produkován ve střevě, jak nedávno navrhli Lund et al . V souladu s tím lze spekulovat, že větší exprese PCSK2 v tenkém střevě jedinců s diabetem typu 2 vede k tvorbě nadbytku glukagonu, což přispívá k diabetické hyperglukagonémii typu 2. Pro další objasnění tohoto aspektu jsou zaručeny studie včetně imunohistochemického dvojitého barvení.
Závěrem lze říci, že současné mapování distribuce enteroendokrinních k A L buněk a pozorované změny v hladinách exprese jejich příbuzných produktů podél lidského střevního traktu v kombinaci s prokázanými rozdíly mezi účastníky s diabetem typu 2 a zdravými jedinci poskytují referenční práci pro vědce a lékaře. V kombinaci se znalostmi z fyziologických studií cirkulujících střevních hormonů by naše údaje mohly mít hodnotu pro pochopení toho, jak střevo přispívá k regulaci metabolismu glukózy a chuti k jídlu. Identifikace PC2 v enteroendokrinních buňkách je zajímavá, protože to může být v souladu s tvorbou glukagonu v lidském střevě. K prokázání této možnosti a propojení našich zjištění s patofyziologií diabetu 2.typu jsou však zapotřebí další studie.
