celková RNA byla extrahována pomocí Tripure Isolation Reagent (Roche).
vzorky RNA byly ošetřeny DNaseI bez Rnázy a vyčištěny pomocí Mini Kit RNeasy (QIAGEN). Výsledná RNA byla zbavena ribozomální RNA pomocí Ribo-Zero rRNA Removal Kit (člověk/myš/potkan) (epicentrum). RNA ochuzená o RNA byla použita k syntéze cDNA prvního řetězce pomocí systému syntézy prvního řetězce SuperScript® III (Invitrogen)podle pokynů výrobce. Následně byl druhý řetězec generován pomocí DNA ligázy E. coli (Invitrogen), e. coli DNA polymeráza (Invitrogen) a sada dUTP, dCTP, dATP a dgtp (každý 10 µmol, Promega) ve druhém vláknovém pufru (Invitrogen). Poté byla cDNA zkrácena Covarisem na zhruba 300 BP. Po fragmentaci byly vzorky čištěny Minelutovými sloupci (Qiagen). A vyčnívající 3′ a 5 ‚ konce fragmentů byly opraveny pomocí T4 DNA polymerázy (NEB) a T4 DNA polynukleotid kinázy (NEB) v pufru T4 DNA ligázy (NEB). Dále byly konce dA generovány použitím Klenowova fragmentu (3′ – >5‘ exo-, NEB) v bufferu 2 (NEB). Reakce ligace adaptéru byly poté nastaveny pomocí indexovaných adaptérů a rychlé ligázy (NEB). Produkty byly použity jako šablona pro léčbu UNG (Fermentas) a amplifikaci PCR pomocí Phusion High-Fidelity DNA polymerázy (NEB). Knihovny byly vizualizovány na 2% Agarózových gelech E-Gel® pro všeobecné použití (Invitrogen). Čárové kódy knihovny byly sekvenovány na jednom pruhu hiseq2500 (Illumina).
