High Fidelity & efektivní PCR enzym: kod DNA polymeráza
hypertermofilní archaea Thermococcus kodakaraensis KOD1 (dříve Pyrococcus kodakaraensis KOD1) (obr. 1) byl izolován ze solfatarického horkého pramene (obr. 2) na ostrově Kodakara (obr. 3) v Japonsku, a byl identifikován a charakterizován.
v tomto kmeni KOD1 byla nalezena rodina B DNA polymeráza (KOD DNA polymeráza) a vykazuje různé jedinečné vlastnosti (1).
-
obr. 1. Thermococcus kodakaraensis KOD1
-
obr. 2. Solfatara (Ostrov Kodakara, Japonsko)
-
obr. 3. Ostrov Kodakara (Prefektura Kagošima, Japonsko)
KOD DNA polymeráza vykazuje silnou 3’→5 ‚ exonukleázovou aktivitu (proof-reading activity), což je aktivita, kterou Taq DNA polymeráza postrádá.
navíc tento enzym vykazuje vynikající procesivitu a schopnost prodloužení, vykazuje pětinásobně vyšší rychlost rozšíření (100-130 nukleotidů/sekundu) a 10-15krát vyšší procesivitu (>300 bází) než u Pyrococcus furiosus (PFU DNA polymeráza). Rychlost prodloužení tohoto enzymu je přibližně 2krát vyšší než rychlost Taq DNA polymerázy (Tabulka 1) (obr. 4) (1).
Tabulka 1. Vlastnosti termostabilních DNA polymeráz
| Proterty | hodnota pro indikovanou DNA polymerázu | ||
|---|---|---|---|
| KOD DNA polymeráza | PFU DNA polymeráza | Taq DNA polymeráza | |
| původ | Archaea | Archaea | bakterie |
| odvozená molekulová hmotnost (kDa) | 90.0 | 90.1 | 93.9 |
| optimální teplota (ºC) | 75 | 75 | 75 |
| optimální pH při 75ºC | 6.5 | 6.5 | 8.0-8.5 |
| termostabilita (poločas) | 95ºC, 12 h; 100oC, 3,0 h | 95ºC, 6h; 100ºC, 2,9 h | 95ºC, 1.6h |
| 5’→3′ exonuclease activity | – | – | – |
| 3’→5′ exonuclease activity | + | + | – |
| Terminal transferase activity | – | – | – |
| Processivity (bases) | >300 | <20 | ND |
| Elongation rate (bases/s) | 106-138 | 25 | 61 |
Fig. 4. Porovnání rychlostí elongace KOD Pfu a Taq DNA polymerázy.
rychlost prodloužení byla měřena podle délky syntetizované DNA za použití M13 ssDNA jako šablony při 75ºC.
souběžně se studiem aktivit KOD DNA polymerázy byly vyvinuty neutralizační protilátky pro polymerázu a korekturní aktivity (2). Tyto protilátky mohou být aplikovány na“ technologii hot start PCR “ pomocí KOD DNA polymerázy.
3-D struktura DNA polymerázy byla charakterizována v roce 2003 (obr. 5) (3).
obr. 5. 3-D struktura KOD DNA polymerázy
J.Mol. Biol., 306: 469-477 (2001)
KOD-Plus- (kód č. KOD-201) byl vyvinut na bázi KOD DNA polymerázy a vykazuje vysokou věrnost PCR (Table2).
Tabulka 2. Porovnání mutační frekvence každého PCR enzymu.
| celkové báze Sekvenované | Počet mutovaných bází | frekvence mutací (x10-5) | |
|---|---|---|---|
| KOD-Plus- | 145,753 | 5 | 3.4 |
| KOD FX | 144,535 | 19 | 13.1 |
| PFU DNA polymeráza | 113,080 | 12 | 10.6 |
| long-PCR enzym na bázi Taq | 167,343 | 218 | 130.3 |
| Taq DNA polymeráza | 102,708 | 145 | 141.2 |
věrnost byla měřena jako frekvence mutace sekvenováním produktu PCR. Po klonování PCR produktu (2,4 kb lidské beta-globinové oblasti) bylo vybráno a sekvenováno asi 96 klonů.
KOD FX (kód č. KFX-101) byl vyvinut na základě KOD DNA polymerázy a vykazuje mnohem větší úspěšnost PCR (na základě účinnosti a možností prodloužení) než KOD-Plus – (kód č. KOD-201) nebo jiné PCR enzymy na bázi Taq. KOD FX je také účinný pro amplifikaci ze surových vzorků (např. lyzát myšího ocasu, Kultivované buňky).
obr. 6. Přímá amplifikace ze surového lyzátu ocasu myši
1,2: kod FX
3~6: enzymy jiné společnosti
M: markery
