hodnocení funkčního profilu Lactobacillus fermentum TCUESC01: nový potenciální probiotický kmen izolovaný během fermentace kakaa

Abstrakt

použití střevních probiotických bakterií je v potravinářském průmyslu velmi běžné a bylo zaměřeno na většinu výzkumu v této oblasti. Přesto se v posledních letech výzkum extraintestinálních mikroorganismů výrazně zvýšil kvůli jejich známému potenciálu jako probiotika. Studovali jsme tedy kmen Lactobacillus fermentum (TCUESC01) extrahovaný z fermentujícího kakaa. Nejprve jsme zkoumali vliv pH na růst tohoto kmene a studovali jeho přežití za podmínek podobných podmínkám lidského gastrointestinálního traktu. L. fermentum TCUESC01 prokázal odolnost vůči podmínkám napodobujícím lidský žaludek a střeva a dobře rostl mezi pH 5 a pH 7. Dále jsme podrobili l. fermentum TCUESC01 skladování při 4°C v mléčném roztoku a zjistili jsme, že dobře přežil po dobu 28 dnů. Nakonec jsme měřili náchylnost tohoto kmene k četným antibiotikům a jeho tendenci k autoagregaci. L. fermentum TCUESC01 vykazoval významnou autoagregaci, stejně jako citlivost na většinu testovaných antibiotik. Celkově naše zjištění podporují potenciální použití této extraintestinální bakterie jako dietního probiotika.

1. Úvod

hledání nových probiotik je motivováno vědomím, že každý kmen mikroorganismů má odlišné vlastnosti a může mít jedinečné účinky na lidské zdraví. Historicky se věřilo, že mléčné bakterie v probiotických produktech musely pocházet od lidí kvůli specifičnosti hostitele . Extraintestinální mikroorganismy izolované z fermentovaných potravin obsahujících laktózu nebo fermentované zeleniny však také vykazují slibné probiotické účinky . Předběžné důkazy z naší laboratoře naznačují, že kmeny Lactobacillus získané fermentací vysoce kvalitního kakaa vykazují probiotické vlastnosti: snižují histologické poškození, snižují systémovou koncentraci zánětlivých cytokinů a zvyšují hladiny IgA v séru v experimentálním modelu kolitidy in vivo . Možné použití těchto kmenů v komerčních produktech však závisí na řadě testů doporučených mezinárodními organizacemi. Podle Organizace pro výživu a zemědělství Organizace spojených národů (FAO) a Světové zdravotnické organizace (WHO) by měly být potenciální probiotické kmeny hodnoceny z hlediska jejich funkčních a technologických charakteristik, včetně jejich rezistence během gastrointestinálního průchodu a jejich stability během skladování . Proto jsme hodnotili funkční vlastnosti a bezpečnost kmene Lactobacillus fermentum tcuesc01, který byl izolován během fermentace vysoce kvalitního kakaa.

2. Materiály a metody

2.1. Mikroorganismy a podmínky růstu

kmen Lactobacillus fermentum TCUESC01 (přístupové číslo KU244478, GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KU244478)) byl kultivován v bujónu laktobacilů (1% pepton, 0,8% masný extrakt, 0,4% kvasnicový extrakt, 2% glykosa, 0,5% octan sodný, 0,2% Hydrogenfosforečnan draselný, 0,02% heptahydrát síranu hořečnatého, 0. 005% tetrahydrátu síranu manganatého a 0,02% triammoniové soli kyseliny citronové) (HIMEDIA®, Indie) po dobu 18 hodin při 37°C a skladováno při -80°C v 10% mléčném roztoku (Molico®, Brazílie) obsahujícím 30% glycerolu.

2.2. Analýza růstu a životaschopnosti při různém pH

MRS vývarové roztoky pH 2, pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 a pH 9 byly připraveny přidáním 1 mol * L-1 kyseliny chlorovodíkové nebo 1 mol * L-1 hydroxidu sodného. Před zkouškou byl L. fermentum TCUESC01 kultivován po dobu 18 h a poté zředěn fyziologickým roztokem (0 .85% chloridu sodného) na optickou hustotu (od) 0,3, měřeno při 600 nm (OD600 = 0,3). Studie byly provedeny v 96jamkových mikrodestičkách (Costar®), kde 180 µL MRS při každém pH bylo naočkováno 20 µL aktivní kultury nebo fyziologického roztoku jako kontrola. Mikrodestička byla inkubována při 37°C a od při 600 nm byla stanovena každou hodinu po dobu 10 hodin pomocí spektrofotometru (Molecular Devices®, Versamax tunable microplate reader). Souběžně byly každou hodinu odebírány vzorky z každého pH, naneseny na MRS agar a inkubovány za anaerobních podmínek při 37°C, aby se otestovala životaschopnost buněk.

2.3. In Vitro Tolerance k gastrointestinálním stavům

bakterie byly kultivovány při 37°C přes noc ve 40 mL vývaru MRS, promyty ve fyziologickém roztoku a naočkovány do 20 mL 10% mléčného roztoku. Fermentace mléka mohla pokračovat, dokud nebylo dosaženo pH 4,5, kdy byly bakterie započítány (CFU·mL−1) sériovým zředěním a pokovením na agaru MRS. Kromě toho bylo provedeno sériové ředění ve fyziologickém roztoku (pH 2,5) s pepsinem (3 g / L), následované inkubací při 37°C po dobu 1,5 hodiny. Bakterie byly promyty dvěma cykly centrifugace (5000 ×g / 10 min) a resuspenze ve fyziologickém roztoku, předtím, než byly resuspendovány ve 20 mL 1% prasečí žluči při pH 8,0 (Merck®, Německo) a inkubovány při 37°C po dobu 45 minut. Počty bakterií (CFU * mL-1) byly stanoveny pokovením bakteriálního roztoku v Mrs agaru za anaerobních podmínek při 37°C po dobu 48 hodin po každé inkubační fázi.

2.4. Přežití během chladného skladování v okyseleném mléce

kmen l. fermentum TCUESC01 byl kultivován ve vývaru MRS a poté sklizen centrifugací (5000 ×g/10 min). Bakterie byly poté promyty resuspenzí ve fyziologickém roztoku a znovu peletovány centrifugací. Kultury byly naočkovány do sterilního roztoku 10% netučného mléka, které bylo okyseleno kyselinou mléčnou na pH 4,5 (Synth®, Brazílie). Roztok mléka byl chlazen při teplotě 4°C a jednotky tvořící kolonie (CFU * mL-1) byly počítány sériovým ředěním a pokovováním na agaru MRS za 0, 7, 14, 21 a 28 dní. Životaschopnost kmene byla stanovena ve vztahu k nulovému časovému bodu, který byl považován za 100% přežití.

2.5. Analýza Autoagregace

L. fermentum TCUESC01 byla kultivována ve 20 mL MRS vývaru přes noc při 37°C. bakteriální peleta byla odebrána a resuspendována ve fyziologickém roztoku na OD 0,3 při 600 nm (OD600 = 0,3). Kapacita L. fermentum TCUESC01 pro autoagregaci byla testována inkubací suspenze při 37°C a od byla sledována každou hodinu po dobu 5 h. procentní agregace () byla vypočtena následovně: kde je počáteční optická hustota v nulovém časovém bodě a je optická hustota v době měření. Uvedené výsledky byly průměry plus / minus směrodatné odchylky od tří experimentů.

2.6. Testování citlivosti na antibiotika

L. fermentum TCUESC01 bylo pěstováno po dobu 18 hodin v MRS bujónu při 37°C a zředěno na 0,5 na mcfarlandově stupnici ve fyziologickém roztoku. Antibiotické disky byly umístěny na agarové destičky Mueller-Hinton, které byly poté naočkovány 100 µL suspenze aktivních bakterií. Destičky se pak inkubovaly za anaerobních podmínek po dobu 24 hodin při 37°C. Byly měřeny zóny inhibice kolem disků a bakterie byly klasifikovány jako rezistentní (), středně citlivé (MS) nebo citlivé () na základě standardů uvedených v tabulce 1. Antibiotické disky použité v testu citlivosti byly amoxicilin (AMO, LABORCLIN®, Brazílie, 10 µg), ciprofloxacin (CIP, LABORCLIN, Brazílie, 5 µg), amikacin (AMI, CECON®, Brazílie, 30 µg), azithromycin (AZI, CECON, Brazílie, 15 µg), amoxicilin a kyselina klavulanová (AMC, SENSIFAR®, Brazílie, 30 µg), norfloxacin (nor, laborclin, Brazílie, 10 µg), sulfonamid (sul, NEWPROV®, Brazílie, 300 µg), vankomycin (van, sensifar, Brazílie, 30 µg), streptomycin (est, laborclin, Brazílie, 10 µg), erythromycin (eri, cecon, Brazílie, 15 µg), tetracyklin (tet, sensifar, Brazílie, 30 µg), Imipenem (ipm, cecon, Brazílie, 10 µg), cefalotin (CFL, LABORCLIN, Brazílie, 30 µg), gentamicin (GEN, CECON, Brazílie, 10 µg), cefotaxim (CTX, SENSIFAR, Brazílie, 30 µg), kotrimoxazol (trimethoprim a sulfamethoxazol) (SUT, SENSIFAR, Brazílie, 25 µg), chloramfenikol (sraženiny, SENSIFAR, Brazílie, 30 µg), klindamycin (CLI, cecon, Brazílie, 2 µg), penicilin G (PEN10, Cecon, Brazílie, 10 µg) a cefoxitin (CFO, laborclin, Brazílie, 30 µg).

2.7. Statistické analýzy

výpočty prostředků a směrodatných odchylek, analýzy rozptylu, Tukeyho Vícenásobné srovnávací testy a všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí softwarového programu GraphPad® Prism 5.0. Všechny grafy byly také vytvořeny pomocí programu GraphPad Prism 5.0.

3. Výsledky

3.1. Vliv pH na růst a životaschopnost L. fermentum TCUESC01

L. fermentum TCUESC01 byl schopen růst v médiích při pH 5, pH 6 a pH 7 (Obrázek 1). Růst však nebyl pozorován mimo toto rozmezí pH (Obrázek 1).

(a)

(b)

(c)

(d)

(v)

(f)

(CS)

(h)

(a)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)

Obrázek 1

růst Lactobacillus fermentum TCUESC01 v období od 0 do 10 hodin kultur při 37°C s různým pH: a) růst MRS bez úpravy pH (pH 6,52); b) růst MRS s pH 2; c) růst MRS s pH 3; d) růst MRS s pH 4; e) růst MRS s pH 5; f) růst MRS s pH 6; g) růst MRS s pH 7; h) růst MRS s pH 8; i) růst MRS s pH 9. Každý bod grafiky představuje průměr a směrodatnou odchylku od tří experimentů.

3.2. Tolerance l. fermentum TCUESC01 k gastrointestinálním stavům In Vitro

tolerance L.fermentum TCUESC01 k gastrointestinálnímu průchodu byla hodnocena za podmínek určených k napodobování lidského gastrointestinálního traktu (Obrázek 2). Bakteriální roztok byl pěstován na koncentraci 8,7 × 108 CFU * mL-1 v 10% mléčném roztoku. Po podání bakterií do roztoku obsahujícího pepsin při pH 2,5 po dobu 1,5 h pro simulaci žaludeční šťávy jsme pozorovali statisticky významné snížení () bakteriální koncentrace na 1,23 × 108 CFU·mL−1. Po promytí fyziologickým roztokem byly bakterie podrobeny roztoku 1% prasečí žluči při pH 8,0 po dobu 45 minut, aby se simulovalo střevní prostředí. Po této léčbě jsme pozorovali snížení počtu bakterií o přibližně 1 log (3, 6 × 107 CFU * mL-1). Snížení počtu bakterií během inkubace v simulované střevní šťávě nebylo statisticky nevýznamné.

Obrázek 2

přežití Lactobacillus fermentum TCUESC01 během průchodu simulovaným gastrointestinálním traktem. „Fermentované mléko“ po fermentaci mléka; „simulovaná žaludeční šťáva“ po průchodu ve fyziologickém roztoku pH 2,5 + pepsin; „simulovaná střevní šťáva“ po průchodu ve volské žluči 1%. Každý bod v grafu představuje průměrný a standardní deviant tří experimentů. Statisticky významné snížení () ve vztahu k “ fermentovanému mléku.“

3.3. Přežití l. fermentum TCUESC01 za podmínek komerčního skladování

pro vyhodnocení jejich přežití během skladování byly bakterie L. fermentum chlazeny při teplotě 4°C po dobu 28 dnů v jinak sterilním 10% netučném mléce okyseleném kyselinou mléčnou na pH 4,5 (obrázek 3). Bakteriální kmen byl zpočátku v koncentraci 3,6 × 109 CFU * mL-1, ale po 7 dnech skladování jsme pozorovali statisticky významné snížení počtu bakterií přibližně o 1 log. Od 7. do 21. dne došlo k neočekávanému růstu ze 4, 3 × 108 CFU * mL-1 na 9, 0 × 108 CFU * mL-1. Do 28. dne se koncentrace bakterií snížila na 2,83 × 108 CFU * mL-1.

obrázek 3

přežití Lactobacillus fermentum TCUESC01 ve fermentovaném mléce od 0 do 28 dnů při 4°C. každý bod představuje průměrnou a směrodatnou odchylku tří experimentů. „a“: statisticky významný rozdíl ve vztahu ke dni nula (); „b“: statisticky významný rozdíl ve vztahu ke dni 14; „c“: statisticky významný rozdíl ve vztahu k 21.dni.

3.4. Autoagregace L. fermentum TCUESC01

bakterie se stále více agregovaly až do páté hodiny in vitro kultury, kdy bylo pozorováno maximálně 70,19 ± 1,78% agregace (obrázek 4). Hodinové zvýšení procentní agregace však bylo statisticky významné až do třetí hodiny experimentu ().

obrázek 4

procento autoagregace Lactobacillus fermentum TCUESC01 hodnoceno od 1 .do 5. hodiny kultivace v MRS vývaru při 37°C. „a“: statisticky významný rozdíl ve vztahu k 1. hodině agregace; „b“: statisticky významný rozdíl ve vztahu k 2. hodině agregace,. Každý bod představuje průměrnou a směrodatnou odchylku 3 experimentů.

3.5. Citlivost L. fermentum TCUESC01 na antibiotika

tento kmen L. fermentum showed susceptibility to the majority of antibiotics tested (Table 2). The few exceptions were the fluoroquinolones norfloxacin and ciprofloxacin, the nucleic acid synthesis inhibitors sulfonamide and cotrimoxazole (sulfamethoxazole and trimethoprim), the cell wall synthesis inhibiting glycopeptide antibiotic vancomycin, and the cell wall synthesis inhibiting β-lactam cefoxitin. L. fermentum TCUESC01 byl citlivý na amoxicilin, amoxicilin a kyselinu klavulanovou, penicilin G, β-laktamy cefotaxim a cefalotin, aminoglykosidy amikacin a gentamycin, linkosamid klindamycin, karbapenem imipenem, makrolidy azithromycin a erythromycin, fenikol chloramfenikol a tetracyklin. Kmen byl také středně citlivý na streptomycin.

4. Diskuse

pokyny stanovené FAO a WHO potvrzují potřebu analyzovat funkční vlastnosti a bezpečnost bakterií před návrhem jejich použití v potravinářské matrici . Zpočátku jsme hodnotili schopnost tohoto druhu Lactobacillus růst a přežít při různých pH, a přestože vykazoval růst pouze v rozmezí od pH 5 do pH 7, zůstal životaschopný během 10-h inkubací na všech hodnocených úrovních pH, s výjimkou pH 2. Studie prokázaly širokou variabilitu pH žaludku, když je žaludek prázdný, s průměrnými hodnotami nižšími než pH 4 . Střevní prostředí je stabilnější a pohybuje se mezi pH 6 a pH 8, v závislosti na hodnocené střevní oblasti . Proto i když tato mléčná bakterie neprokázala schopnost množit se nebo přežít pod PH 2, 5, zůstává životaschopná ve střevním rozmezí pH, a proto může být schopna fungovat v tomto prostředí. V souladu s našimi údaji vykazovaly Lactobacillus plantarum (ST194BZ, ST414BZ a ST664BZ), Lactobacillus rhamnosus (ST461BZ, ST462BZ) a Lactobacillus paracasei (ST242BZ, ST284BZ) izolované z běžně konzumovaného fermentovaného nápoje (Boza) z Balkánského poloostrova dobrou rychlost růstu během 10 hodin inkubace mezi pH 5 a pH 7 . L plantarum 423 izolovaný z čirokového nápoje, L. plantarum 241 izolovaný z prasečího ilea, l. curvatus DF38 izolovaný ze salámu a Lactococcus lactis ssp. lactis HV219 izolovaný z lidských vaginálních sekrecí také vykazoval růst mezi pH 5 a pH 6,5 v podobných experimentech . Celkově naše výsledky ukazují, že L. fermentum TCUESC01 má růstovou a pH rezistenci podobnou jiným potenciálním extraintestinálním probiotickým bakteriím. Kromě toho může být citlivost kmene na hodnoty pH nižší než 2, 5 překonána použitím metod, které chrání bakterie, jako je mikroenkapsulace . Naše výsledky podporují potenciální aplikaci tohoto kmene jako probiotické přísady do potravin s výrazně kyselými vlastnostmi, například sýrů, džusů a fermentovaného mléka.

gastrointestinální prostředí může být nepřátelské pro mnoho bakterií; různé stresory, jako je kyselost, trávicí enzymy a žlučové soli, mohou negativně ovlivnit jejich přežití během průchodu do střeva . Lactobacillus v této studii vykazoval diskrétní kvantitativní snížení, ale zůstal životaschopný za žaludečních a střevních podmínek a odolával koncentraci žluči třikrát, která se nachází v lidském střevě (0, 3%) . Podobně jako naše data, Kaushik et al. bylo zjištěno, že Lactobacillus plantarum Lp9 se snížil o přibližně 0, 5 log od své počáteční koncentrace, když byl vystaven podmínkám, které napodobují žaludek (pH 2), a 1 log, když byl vystaven podmínkám, které napodobují střevo. V jiné studii l. rhamnosus VT1/1 izolovaný ze sýra vykazoval snížení koncentrace přibližně 2 log za podmínek nízkého pH (pH 3) a snížení koncentrace 1 log při inkubaci při pH 7 za přítomnosti 2% žlučových solí . Naše výsledky naznačují, že L. fermentum by se mohl pohybovat gastrointestinálním systémem a přežít v koncentracích nad 107 CFU * g-1 (nebo CFU * mL-1), což by podle předchozích studií stačilo k interakci a / nebo interferenci s hostitelským prostředím.

potravinová matrice je také ovlivňujícím faktorem životaschopnosti mikroorganismů během jejich skladování . Při testování dlouhodobého přežití l. fermentum TCUESC01 v okyseleném mléce jsme pozorovali počáteční snížení počtu bakterií následované mírným zvýšením od 7. dne do 21.dne. Tento růst lze vysvětlit pokračujícím bakteriálním metabolismem v mléčném roztoku, i když se sníženou rychlostí v důsledku nízké teploty. Donkor et al. také pozorovány kvantitativní variace probiotických bakterií během skladování při 4°C, zejména Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Lb1466, který vykazoval růst 1 log od 7. dne do 14. dne chladírenského skladu. V jiné studii l. plantarum skladovaný ve fermentovaném mléce významně snížil svou buněčnou koncentraci o 1 log během přibližně 28 dnů skladování při 4°C . Ačkoli L. fermentum vykazoval pokles o 1 log od své počáteční koncentrace do posledního dne skladování, jeho koncentrace byla nadprůměrná k datu expirace mléčného roztoku . Podobně na základě doporučení Národní agentury pro hygienické monitorování (ANVISA), L. fermentum TCUESC01 by mohl být zaveden do potravinářských matric podobných fermentovanému mléku a přežít v odpovídajících koncentracích až do data exspirace produktu .

mikroorganismy se schopností autoagregace zůstávají ve střevech delší dobu a mají tak lepší interakce s epiteliálními buňkami a imunitním systémem hostitele . Kmen l. fermentum TCUESC01 prokázal zvýšenou kapacitu pro autoagregaci v naší 5-h studii. Tento výsledek je vyšší než výsledek, který uvádí Beganović et al. , který prokázal, že L. fermentum A8 má 60,9 ± 3.91% autoagregace po 5 hodinách inkubace, nebo to, co uvádí Bao et al. , který prokázal autoagregaci méně než 28% pro 10 kmenů L. fermentum po 20-h inkubaci. Na základě našich výsledků se L. fermentum dobře agreguje a při požití by pravděpodobně mohl přetrvávat v lidském střevním prostředí po dlouhou dobu.

nakonec jsme vyhodnotili citlivost TCUESC01 na různé antibiotika. Znalost citlivosti na antibiotika je nesmírně důležitá, pokud vezmeme v úvahu tři důležité faktory: vzácná možnost infekce Laktobacilem, riziko horizontálního přenosu genů rezistence na nativní mikroby a souvislost mezi probiotickými bakteriemi a léčbou antibiotiky. L. fermentum TCUESC01 vykazoval citlivost na většinu antibiotik, s výjimkou inhibitorů syntézy nukleových kyselin (norfloxacin, ciprofloxacin, sulfonamid a kotrimoxazol) a dvou inhibitorů syntézy buněčné stěny (vankomycin a cefoxin). Tyto výsledky potvrzují údaje zveřejněné Kirtzalidou et al. na 74 kmenech Lactobacillus ssp. izolován z lidských výkalů, z toho 94.5% kmenů bylo rezistentních na amikacin, všechny byly rezistentní na kanamycin a ciprofloxacin, 84, 7% kmenů bylo rezistentních na vankomycin, 1, 6% kmenů bylo rezistentních na cefalotin a 8, 5% kmenů bylo rezistentních na bacitracin. Laktobacily obecně vykazují vnitřní rezistenci na chinolony, trimethoprim, sulfonamidy, vankomycin a většinu inhibitorů nukleových kyselin, přičemž vykazují citlivost na inhibitory syntézy proteinů s výjimkou aminoglykosidů . Je třeba poznamenat, že zde pozorovaná rezistence vůči antibiotikům je vlastní rodu, jak je zřejmé z publikovaných studií, a horizontální přenos genů je proto neobvyklý. Stručně řečeno, profil rezistence l. fermentum TCUESC01 podporuje možnost použití společně s antibiotiky, které působí inhibicí syntézy nukleových kyselin.

5. Závěry

přestože se jedná o extraintestinální kmen izolovaný během fermentace kakaa, l. fermentum TCUESC01 vykazuje silný potenciál jako probiotikum pro aplikaci v potravinářských výrobcích. Zůstává životaschopný v širokém spektru pH, a je proto vhodný pro zařazení do různých druhů potravin. Při skladování v chlazeném mléčném výrobku udržuje životaschopnost nad úrovní doporučenou uznávanými národními a mezinárodními organizacemi až do data expirace produktu. Za podmínek, které napodobují gastrointestinální průchod, přežívá také v množství dostatečném pro udržení probiotického potenciálu. Pokud jde o jeho předpokládané chování ve střevech, l. fermentum TCUESC01 vykazuje silnou tendenci k autoagregaci. Nakonec tento kmen vykazuje profily citlivosti na antibiotika a rezistence, které umožní jeho použití spolu s lékovými terapiemi. Dohromady tyto vlastnosti naznačují, že L. fermentum TCUESC01 má velký potenciál jako bezpečná probiotická potravinářská přídatná látka.

střet zájmů

autoři prohlašují, že nemají žádný střet zájmů.

poděkování

tento výzkum byl podpořen grantem Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB). Conselho de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) a Coordinação de Aperfeiçoamento De personnels de niveau Superior (CAPES) poskytovaly některým autorům produktivitu a postgraduální stipendia.