C. Polyakrylamid vložený fluorescenčními kuličkami
jak je popsáno v předchozí části, křemíkové substráty se ukázaly jako cenné při měření sil vyvíjených rychle se pohybujícími keratocyty. Tyto stejné substráty jsou však mnohem méně užitečné pro studium většiny savčích buněk. Aby byly trakce přesně vypočteny, musí být substrát vyladěn tak, aby odpovídal tvorbě pohyblivosti a síly daného typu buňky. Je obtížné přesně vyrobit křemíkový substrát požadované shody pro pomaleji se pohybující buňky schopné vyvinout vyšší síly. K překonání tohoto omezení použili Dembo a Wang (1999) substrát polyakrylamidu vložený do fluorescenčních kuliček velikosti submikrometru. Soulad polyakrylamidových substrátů lze chemicky vyladit změnou koncentrací monomeru a zesítění (Pelham a Wang, 1997). Polyakrylamid nabízí několik dalších výhod oproti křemíkovým substrátům. V širokém rozsahu deformací vykazuje lineárně elastické chování. Také polyakrylamid není typicky přístupný pro vazbu buněk sám o sobě, bez konjugace specifických buněčných adhezních ligand (Nelson et al ., 2003). Proto je to perfektní lešení pro studium adheze a chování buněk kontrolovatelným, definovaným způsobem.
výpočetní metoda, kterou se deformace v substrátu používají ke stanovení trakcí vyvíjených buňkou, je velmi podobná metodám použitým na výše zmíněných namáhaných křemíkových substrátech. Použití fluorescenčních markerů však výrazně zlepšilo metodu sledování a schopnost vypočítat přesné kmenové pole.
Dembo a Wang publikovali několik studií s využitím výsledné techniky, mikroskopie tažné síly, která objasňuje mechanismy migrace fibroblastů. Konkrétně ukázali, že lamellipodie buňky poskytují téměř veškerou sílu potřebnou pro pohyb vpřed (Munevar et al., 2001a). Jejich výsledky naznačují, že lamellipodium je mechanická entita odlišná od zbytku buněčného těla. Zajímavé je, že se zdá, že stejné mechanické dělení v buňce neexistuje v H-Ras transformovaných buňkách, což možná vysvětluje rozdíl v jejich pohyblivém chování. Navíc Beningo a kol. (2001) zkoumal roli fokálních adhezí při regulaci tvorby trakce a zjistil, že velikost fokálních adhezí nepřímo souvisí s množstvím generované síly. Kromě toho distribuce adhezí neodpovídá dobře rozložení tažných sil. Autoři dospěli k závěru, že tyto výsledky mohou naznačovat, že časné fokální komplexy jsou zodpovědné za silné hnací síly, a zrání těchto adhezních míst vede ke změně na pasivní kotevní místa — závěr, který byl v literatuře široce diskutován. Dembo a spolupracovníci navíc zkoumali dynamické role, které adheze vpředu versus vzadu (Munevar et al ., 2001b), myosin IIb (Lo et al., 2004), fokální adhezní kináza (Wang et al., 2001) a protáhlé Ca2+ kanály hrají v migraci fibroblastů (Munevar et al ., 2004). Pomocí mikroskopie tažné síly, Dembo a spolupracovníci dosáhli významného pokroku v porozumění úloze generování síly při migraci fibroblastů.
jedním z nejvýznamnějších technických pokroků při použití polyakrylamidového gelu je schopnost spolehlivě kontrolovat poddajnost buněčného substrátu bez změny hustoty ECM. Vyladění shody substrátu bylo kritickým bodem obratu ve vývoji mikroskopie tažné síly, protože umožnilo zkoumání téměř jakéhokoli typu buňky a pochopení chování buněk jako funkce mechanického prostředí. Před studií Pelhama a Wanga (1997) se většina studií zkoumajících migraci a adhezi buněk zaměřila na migraci buněk v reakci na rozpustné chemické prostředí (chemotaxe) nebo v reakci na ligand konjugovaný se substrátem (haptotaxe). Studie zahrnující mechanické prostředí buňky se navíc zaměřily na odezvu způsobenou působením sil, jako je smykové napětí kapaliny a mechanické roztažení. Změnou tuhosti substrátu však Pelham a Wang (1997) vytvořili významný posun ve způsobu, jakým vědci přistupují k buněčné odpovědi a mechanotransdukci. Použitím polyakrylamidových substrátů Pelham a Wang udržovali hustotu ECM na substrátu konstantní a zároveň měnili mechanickou shodu. Prokázali, že fibroblasty jsou schopny aktivně reagovat na mechanickou shodu jejich substrátu. Buňky na tužších gelech se více šíří a migrují pomaleji než buňky na více vyhovujících gelech. Navíc schopnost buněk vnímat mechanickou shodu jejich substrátu se odráží v jejich schopnosti měnit fosforylační stav četných proteinů obsažených v fokální adhezní struktuře. Fokální adheze na tuhých substrátech jsou větší, protáhlejší a stabilnější, zatímco fokální adheze na více vyhovujících substrátech obsahují méně fosforylovaného pp125FAK a paxilinu a objevují se mnohem nepravidelněji. Tyto výsledky byly první, které naznačují, že mechanické podněty ECM mohou být stejně důležité jako chemické podněty při regulaci adheze buněk.
od klíčového článku Pelhama a Wanga (1997) řada studií zkoumala účinky shody na chování buněk. Lo et al. (2000) použila polyakrylamidovou chemii k vytvoření substrátu obsahujícího stupeň tuhosti — centrální oblast substrátu, kde se setkávají dva substráty s různými shodami. Prokázali chování zvané durotaxe, pomocí kterého byly buňky schopny aktivně detekovat a reagovat na změny v souladu se substrátem. Buňky, které migrovaly na měkkém substrátu, při zasažení hranice tuhého měkkého přechodu, by přešly na tuhý substrát, zatímco buňky na tuhých substrátech vykazovaly vyšší trakce a rozšířenější oblast, a buď zatažené nebo změněné směry v reakci na tuhou měkkou hranici. Později, Wong et al. (2003) zkoumala schopnost fibroblastů migrovat na polyakrylamidové hydrogely obsahující gradienty shody, spíše než krok, jak to udělali Lo a spolupracovníci. Zjistili, že buňky hladkého svalstva cév mají tendenci migrovat rychleji na měkčích substrátech než na tužších substrátech (15 kPa vs. 25 kPa) a že buňky mají tendenci se hromadit na tužších substrátech. Navíc se zdálo, že migrační vzor na gelech kompatibilních s gradientem směřuje spíše k tužším gelovým oblastem, než aby vykazoval typický vzorec náhodného chůze charakteristický pro migraci buněk. Engler a kol. (2004) dále zkoumala buněčnou odpověď na vyhovující gely a ukázala, že odpověď je z velké části zprostředkována sestavením aktinového cytoskeletu. Testováním změn v cytoskeletu byli Engler a spolupracovníci schopni prokázat, že mírná nadměrná exprese aktinu v buňce může kompenzovat ztrátu šíření pozorovanou v reakcích měkkého gelu. Dodatečně, Yeung a kol. (2005) ukázalo, že práh citlivosti pro snímání shody je specifický typ buňky a že kontakty mezi buňkami mohou také pomoci zachránit morfologické změny pozorované v měkkých substrátech, aby se více podobaly morfologii buněk na tužších substrátech (Yeung et al ., 2005). Celkově je studie durotaxe stále relativně mladá a zbývá se ještě hodně naučit o tom, jak buňka mechanicky snímá a reaguje na materiálové vlastnosti svého substrátu a prostředí.
