2.3.4.1 struktura
homodimer apo-sCTLA-4 byl exprimován jako fúzní protein Fc štěpitelný trombinem v buňkách CHO v přítomnosti kifunensinu.23 po deglykosylaci poskytl homodimer krystaly difrakční do Braggových rozestupů 1,8 Å, s jednotkovými rozměry buněk a = 43,86 Å, b = 51,46 Å a c = 102,85 Å a vesmírnou skupinou P212121 (Ref . 130). Struktura byla řešena molekulární náhradou. Asymetrická jednotka sestávala z homodimeru vázaného na disulfidy, což umožnilo srovnání s komplexy sCTLA-4/sB7-1 a sCTLA-4/sB7-2 a se sCTLA-4 vázaným na upravený lipokalin.131
dva monomery v asymetrické jednotce byly složeny z β-sendvičových domén s topologií AGFCC a Abed, jak předpokládali Metzler et al.132 krátký osm reziduí“ stonek “ disulfid vázaný na Cys122 spojil IgSF domény s membránou. Neočekávaně byly obě poloviny homodimeru apo-CTLA-4 méně podobné než jejich komplexním protějškům, přičemž zdůrazňovaly, že vazba není doprovázena rozsáhlými strukturálními přesmyky (obr. 2,2 H). Automatizovaná srovnání struktury identifikovala CD28 a PD-1 jako struktury nejvíce podobné CTLA-4. Důležité rozdíly mezi CTLA-4 a CD28 byly: (i) přítomnost zalomení v β-řetězci G CD28, (ii) změny velikosti smyčky včetně prodloužených smyček AB, BC a CC v CTLA-4 a zkrácené smyčky C“D a (iii) H-spojení řetězců C‘ A C“ β v důsledku přemístění smyčky C‘ C“ v CD28. Klíčovou důležitostí byla do značné míry identická konformace sekvence FG smyčky 99MYPPPY104 tvořící jádro jejich povrchů vázajících ligand. Na neobvykle suchém povrchu apo-CTLA-4 vázajícím ligand byla nalezena pouze jedna molekula vody, zatímco jinde bylo detekováno 228 vod.
po CD28 a PD-1 byly další nejpodobnější struktury k doméně CTLA-4 V-set 215 protilátkových nebo TCR V-domén, lišících se většinou pouze délkou smyčky. R.m. s. rozdíl pro superpozici CTLA-4 s nejpodobnější doménou TCR va byl 2,09 Å pro 102 reziduí, v kontrastu s 2,89 Å pro 86 reziduí pro superpozici s D1 CD2. Mezi důležité sdílené funkce s doménou Va patřila dlouhá CC ‚smyčka a konzervované β-boule v C‘ A G β-pramenech, které ukládaly výrazný zvrat na β-list AGFCC. Zvláště pozoruhodný byl vysoký stupeň zachování sekvencí a konformace Ca v blízkosti G řetězce β-boule, to znamená GNGTQIYV (CTLA-4) a GDGTQLVV (Va). V CD2 a CTLA-4, smyčky byly podobné, a domény se lišily, pokud: (i) v CD2 nedošlo k H-vazbě ßA a ßB řetězců, (ii) nedošlo ke zkroucení β-listu a‘ GFCC ‚v CD2 v důsledku přemístění β-vyboulení, (iii) Poloha c“ β-řetězce v CD2, ale ne CTLA-4, umožnila kanonickou H-vazbu a prodloužení β-listu AGFCC ‚C“, a (iv) CTLA-4 postrádala zkroucení ve smyčce FG přítomné v CD2 (a také např. B7-1). Analýza padesáti dvou domén IgSF v-množiny pomocí programu sekvenčního zarovnání struktur133 ukázala, že rodina CD28 / CTLA-4 zahrnuje podskupinu domén v-množiny odlišnou od seskupení CD8, antigenních receptorů a molekul“ adheze“, například B7-1 a CD2. Celkově byla větší podobnost podskupiny CD28 / CTLA-4 s rodinou antigenních receptorů ve srovnání se sadou adhezí. Analýza naznačila, že proteiny rodiny CD28/CTLA-4 a antigenní receptory sdílely společného předka pravděpodobně podobného PD-1, přičemž obě rodiny se brzy rozcházely.
apo-CTLA-4 obsahoval homodimer s jeho podjednotkami, které přijímaly uspořádání podporující ortogonální bivalentní interakce s ligandy umístěnými na povrchu buněk. Srovnání s MONOMERNÍMI páry CTLA-4 v komplexech B7-1 a B7-2106, 107 a monomerem v komplexu lipokalin131 odhalilo velmi omezenou rotační flexibilitu na homodimerovém rozhraní a pozoruhodně málo, pokud existují, změn, které lze přičíst vazbě ligandu. Jediné rozdíly byly patrné v komplexu B7-2, s mírným přemístěním smyček BC a CC, a c “ β-řetězce a sousedních smyček, a konformační rozdíly v G β-řetězci na jeho c-konci. Tyto lokální variace byly vzdálené od místa vazby ligandu CTLA-4 a v žádném případě se monomery apo systematicky nelišily od všech pěti komplexovaných monomerů CTLA-4. Pozice atomů hlavního řetězce sekvence 99MYPPY104 byly v podstatě identické.
struktury komplexů tvořených CTLA-4 s B7-1 a B7-2, které dříve nebyly porovnávány, byly zcela odlišné.130 substituce v B7-2, val28 vs Arg29 v B7-1, vytvořila vazebnou kapsu v B7-2, která byla vyplněna pouze částečně CTLA-4. To zajistilo, že komplex B7-1 / CTLA-4 vykazoval lepší komplementaritu tvaru než komplex B7-2/CTLA-4. Mírně to kompenzovalo, povrchová plocha pohřbená v B7-2 CTLA-4 byla o něco větší než plocha pro B7-1. Celkově, B7-1 vázaný CTLA-4 ještě pevnějším způsobem než CTLA-4 zapojený B7-1. Vazba B7-2 CTLA-4 byla však složitější a nesla punc “ indukovaného fit.“V CTLA-4 bound-vs apo-B7-2 došlo k posunu 2,3-3,5 Å smyčky B7-2 FG směrem k CTLA-4, který byl iniciován ~ 120 stupňovou rotací Phe31 B7-2 (Ref. 130). Tím vznikla stohovací interakce Phe31 s Pro102 sekvence 99MYPPY104 CTLA-4.
