vzhled
buňky Klebsiella pneumoniae se ve světelně mikroskopickém obrazu objevují jako krátké tyčinky o délce 1-2 mmol a šířce 0,5–0,8 mmol. Jsou přítomny jednotlivě nebo v párech a jsou obklopeny slizniční kapslí (Glykokalyx). V Gramově zbarvení jsou zbarveny růžově až červeně, jsou gramnegativní. Jak je typické pro rod Klebsiella, nejsou aktivně pohyblivé (motil), takže nemají bičíky (bičíky). Povrch buněk je však obsazen Fimbriemi. Bakteriální kolonie pěstované na živné půdě nemají zvláštní zbarvení, jsou konvexně vyvýšené, kulaté v dohledu a poměrně velké o průměru 3-4 mm, typický je jejich slizký vzhled. To je způsobeno nahromaděním extracelulárních polysacharidů, které spolu s přítomnou vodou tvoří Biofilm.
růst a metabolismus
jak je obvyklé u zástupců Enterobacteriaceae, test katalázy je pozitivní a test oxidázy negativní. Klebsiella pneumoniae je fakultativně anaerobní, což znamená, že může růst s kyslíkem nebo bez něj. Je schopen využít disacharid laktózy. Další informace naleznete v části biochemické důkazy.
kromě toho je jedním z mikroorganismů fixujících dusík, může redukovat elementární molekulární dusík (N2) na amoniak (NH3) nebo amoniak (NH4+) a tím učinit biologicky dostupným. To se provádí pomocí enzymatického komplexu Nitrogenázy v anoxickém prostředí, protože enzymatický komplex je inaktivován kyslíkem. Klebsiella pneumoniae je diazotropní, takže může růst s N2 jako zdrojem dusíku, aby se z něj vytvořily buněčné látky, jako jsou aminokyseliny.
pro kultivaci jsou vhodná jednoduchá živná média, např. kasein-sojový-Peptonový Agar (CASO-agar), bakterie lze pěstovat i na Columbia-Bloodagaru. Často se používají selektivní živná média vhodná k izolaci a rozlišení zástupců enterobakterií, jako je Agar MacConkey a eosin-Methyl-modrý Agar (EMB), které oba obsahují laktózu. Pro další selekci se doporučuje živné médium, které jako zdroj uhlíku (organická sloučenina pro výrobu energie) obsahuje pouze citrát a Inositol na bázi citrátového agaru Simmons s přídavkem 1% inositolu. Klebsiella pneumoniae je mezofilní, Optimální růst probíhá při teplotě 30-37 mmol C, po inkubaci po dobu jednoho až dvou dnů jsou viditelné kolonie. K růstu dochází také při 41 madagascarech C, ale ne při 5 madagascarech C. Kmeny bakterií izolovaných z lékařského vyšetřovacího materiálu obvykle optimálně rostou při teplotě 37 cholesterin C, ale různé detekční reakce pro identifikaci jsou lepší při inkubační teplotě 30 ely.
Chemotaxonomie
složky bakteriálních buněk působí jako antigeny, u Klebsiella to je 77 různých K antigenů (k odkazuje na tobolku) a 9 somatických o antigenů. Diagnostický význam mají K-antigeny, sérologické vyšetření umožňuje rozlišit různé sérotypy, což mj. používá se při objasňování epidemiologických souvislostí. Existuje však také metoda ELISA pro detekci O-antigenů. Stanovení lze provést také pomocí genetického vyšetření.
genetika
obsah GC, tj. podíl guaninu a cytosinu nukleových bází v DNA bakterií, je u bakteriálního kmene DSM 30104 (z kmenové sbírky DSM Deutsche Collection mikroorganismů a buněčných kultur) 57,0 molárních procent. DSM 30104 je kmen poddruhu Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, a tedy i druh, byl izolován z lidské krve. Genom byl kompletně sekvenován v roce 2012.
je to Kruhový bakteriální chromozom o velikosti 5512 Kilobáz (kb), což je přibližně srovnatelné s velikostí genomu Escherichia coli. Je přítomno 5425 kódujících genů a bylo identifikováno 77 tRNA. Geny byly porovnány s databází genů rezistence vůči antibiotikům (ARDB), bylo identifikováno 15 genů, které zprostředkovávají rezistenci. a. pro třídu a Beta-laktamázu a efluxní pumpu. Deset dalších genů kóduje genové produkty, které rozšiřují schopnost bakterie působit na laktamázu, včetně genu zvaného ampC, který kóduje Enzym zvaný AmpC-Beta-laktamáza (v tomto případě Cefalosporináza), a genu zvaného gloB, který kóduje Enzym zvaný Metallokeramáza-laktamáza (v tomto případě Karbapenemáza). Od té doby bylo více než 4.200 genomů tohoto druhu (vztaženo k cirkulačnímu bakteriálnímu chromozomu), kromě toho bylo provedeno 913 anotací plasmidů (k roku 2018).
plasmidy často nesou genetickou informaci o bakteriální rezistenci vůči antibiotikům (viz níže), genové produkty jsou enzymy, které mění určitou chemickou strukturu antibiotika a tím zabraňují působení léčiva. V případě Klebsiella pneumoniae se jedná o Beta-laktamázy kódované plazmidem, jako jsou SHV-1, TEM-1, TEM-2 nebo další ESBL (Extended Spectrum antarctamases).Od počátku 21. století byla také pozorována rezistence na karbapenemy způsobené Karbapenemázou (karbapenem hydrolyzující beta-laktamázou), která se podle produkující bakterie nazývá KPC (Klebsiella pneumoniae Karbapenemáza), různé varianty se nazývají KPC-1, KPC-2 nebo KPC-3. Zvláštností plasmidů je, že jsou vyměňovány horizontálním přenosem genů mezi různými druhy bakterií, a tím je rezistence vůči antibiotikům „přenášena“. Klinický případ přenosu plazmidu genem blaKPC-3 Z K.pneumoniae na k. aerogenes je popsán v tomto článku.
studium sekvence nukleotidů jednotlivých genů ukázalo, že druh Klebsiella pneumoniae je velmi rozmanitý. Další genetické testy, například modifikace PCR s náhodným duplikováním polymorfní DNA (RAPD), potvrzují přítomnost tří různých fylogenetických skupin označovaných jako KpI, KpII a KpIII. Nejsou identické se třemi poddruhy. Další genetické testy v posledních letech, jako je sekvenování 16S ribozomální RNA (rRNA) a multi-Locus sekvenční analýza (MLSA) některých genů, vedly ke klasifikaci zástupců skupiny KpII jako Klebsiella quasipneumoniae a fylogenetické kmeny Kpiii jako Klebsiella variicola.
patogenita
tři poddruhy k. pneumoniae jsou zařazeny do rizikové skupiny 2 nařízením o biocidních přípravcích ve spojení s TRBA (technická pravidla pro biologické činitele) 466. K.pneumoniae subsp. pneumoniae a k.pneumoniae subsp. rhinoscleromatis má také poznámku ht, která naznačuje, že bakterie je patogenní pro člověka a obratlovce, ale obvykle nedochází k přenosu mezi oběma skupinami hostitelů.
k. pneumoniae má několik faktorů virulence. Kapsle (Glykokalyx) chrání před fagocytózou prostřednictvím fagocytů, buněk imunitního systému. Přitom narušuje systém komplementu podílející se na obraně mikroorganismů tím, že brání jeho aktivaci nebo absorpci již uvolněných polypeptidů, jako je C3b. Adheziny umožňují přichycení k hostitelským buňkám. Některé Adheziny k. pneumoniae působí současně jako Hemaglutininy a jsou přiřazeny Fimbriím (Pili). Fimbrie typu 1 vedou u erytrocytů morčat k viditelnému shlukování (aglutinaci), připojují se k lidským epiteliálním buňkám střeva nebo epiteliálním buňkám močových cest. K. izoláty pneumoniae z lékařských vzorků vytvářejí více fimbrií typu 1 než izoláty ze vzorků životního prostředí. Vyskytují se také fimbrie typu 3, zprostředkovávají Přichycení bakterií na rostlinný kořenový systém, stejně jako u lidí na endoteliálních buňkách, epiteliálních buňkách plicních sklípků a močových cest a na kolagen typu v. Předpokládá se, že jsou zodpovědní za kolonizaci invazivních zdravotnických prostředků, které zůstávají v těle po dlouhou dobu.
lipopolysacharidy (LPS) vnější membrány působí jako antigeny, navenek nasměrované polysacharidové řetězce jsou označovány jako antigeny O (srovnejme Kauffmannův-Whiteův systém používaný u salmonel). K. pneumoniae má devět různých O antigenů, přičemž O1 je nejčastější. O-antigeny také narušují reakční kaskádu systému komplementu. Kromě toho se O1 podílí na nekróze infikovaných tkání. Bakteriální Siderofory jsou také důležité pro patogenitu. Slouží k tomu, aby zásobovaly buňky ionty železa, které jsou nezbytné pro metabolismus tím, že se vážou na ionty Fe3+. K. pneumoniae vytváří Enterobactin (Enterochelin), zatímco pouze některé kmeny navíc produkují Aerobactin. U sérotypů K1 a K2 byl nalezen plazmid, na kterém je genetická informace kódována pro Hydroxamát Aerobactin. Pokud jsou tyto geny přeneseny do kmene bez plasmidu pomocí transformace, vykazují transformované buňky 100krát zvýšenou virulenci. Také Yersiniabactin, Siderofor typický pro druhy Yersinia, je tvořen některými kmeny.
biochemické Detekceeditovat
k. pneumoniae je blízce příbuzný k. aerogenes (dříve zařazený do rodu Enterobacter) a Enterobacter cloacae. Bakterie vykazují výraznou všestrannost, pokud jde o využití různých uhlohydrátů a vykazují až na několik výjimek stejné biochemické vlastnosti, jako například přítomné enzymy a z toho vyplývající metabolické vlastnosti.
zástupci rodu Klebsiella provádějí jako typické kvašení 2,3-Butandiolové kvašení pro získání energie, ve Vogesově-Proskauerově testu je prokázán Acetoin, meziprodukt 2,3-Butandiolového kvašení. Zástupci příbuzných rodů Enterobacter a Klebsiella reagují pozitivně. To platí v zásadě i pro K.pneumoniae, ale poddruhy nebo jednotlivé kmeny bakterií vykazují různé reakce, tedy i negativní výsledek v testu VP. Typový kmen DSM 30104 je na rozdíl od popisu druhu VP negativní (neprodukuje tedy Acetoin z pyruvátu), zato vykazuje pozitivní výsledek v testu Methylčervené barvy, což je typické pro zástupce smíšené kyselé fermentace. Tyto rozdíly ve fyziologickém fenotypu odrážejí genetickou rozmanitost druhu bakterií. Ani další biochemické vlastnosti nejsou v rámci druhu jednoznačně stanoveny. Indol Test je v zásadě vhodný jako rozlišovací znak mezi k.pneumoniae (indol negativní) a Klebsiella oxytoca (indol pozitivní), ale existují i některé indol pozitivní kmeny k.pneumoniae.
další detekční práce
místo detekce bakterie se často omezuje na stanovení sérotypu nebo detekce jednotlivých faktorů virulence nebo genů rezistence. K-A O-antigeny mohou být určeny jak“ konvenčně “ sérologicky (v anglické literatuře označované jako sérotyping), tak od rozšíření molekulárně biologických metod, například pomocí Multi-Locus sekvenční analýzy (MLSA). Porovnáním s četnými sekvenovanými genomy tohoto druhu bylo prokázáno, že u kmenů s Kapsulárními antigeny K1 nebo K2 se téměř vždy vyskytuje sérotyp O1. Sérotypy K1 a K2 jsou považovány za hypervirulentní. Stanovení kapslových antigenů může být také provedeno pomocí multiplexní PCR (je detekováno více než jedna genomová část) a pulzní gelovou elektroforézou (PFGE).
identifikace metodou MALDI-TOF v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (MS) je v zásadě vhodná pro detekci Klebsiella, ale není vždy spolehlivá, pokud jde o rozlišení blízce příbuzných rodů, např. raoultella. Spektra mnoha gramnegativních druhů patřících k enterobakteriím vykazují velkou shodu (od roku 2013), což ztěžuje identifikaci. Další systematická studie bakterií kultivovaných v tekutém živném roztoku obsahujícím krev ukázala, že zejména bakterie v kapsli nejsou správně identifikovány. Naproti tomu při detekci antibiotické rezistence lze použít MALDI-TOF k detekci nepřítomnosti nebo snížené přítomnosti proteinů ve vnější membráně (OMP). Při K. pneumoniae je důležitý OmpK36, důležitý membránový pór, kterým se do buňky dostávají laktamová antibiotika. U rezistentních kmenů chybí nebo se tvoří v malém počtu.
