Kluyveromyces marxianus rozvoj tolerance ethanolu během adaptivní evoluce s významným zlepšením více cest

Zlepšená odolnost vůči ethanolu po 100denní evoluci

divoký typ haploidní kmen k. marxianus byl kultivován v médiu s 6% (v/v) ethanolem při 30 °C po dobu 100 dnů asi 450 generací (viz metody pro podrobnosti). Během tohoto období došlo k neustálému zvyšování biomasy (měřeno OD600 denně) (obr. 1a), což naznačuje, že přežití buněk při stresu z ethanolu může být zlepšeno. Nakonec jsme získali populaci k. marxianus s výrazně zlepšenou odolností vůči ethanolu (obr. 1b). Po celou dobu KM odkazuje na surový kmen před evolucí a KM-100d odkazuje na populaci k. marxianus po 100denní evoluci. Maximální odolnost ethanolu pro KM byla 7% (v / v)A Pro KM-100d byla až 10% (obr. 1b). Porovnali jsme růstové profily mezi KM a KM-100d v kultivačním médiu s různými hladinami ethanolu(0%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% v / v, obr. 1c). Při absenci ethanolu nebyl mezi kmeny významný rozdíl. Jejich rozdíl se zvyšoval se zvýšením hladiny ethanolu a dosáhl maxima s 6% (obj./obj.) ethanolu v kultivačním médiu. Za takových okolností byla po 48 h biomasa KM-100d téměř dvojnásobně vyšší než biomasa KM. Oba kmeny vykazovaly retardovaný růst v médiu se 7% ethanolem a nepodařilo se růst v médiu s 8% ethanolem. Kromě toho KM-100d také vykazoval pozoruhodně vyšší maximální rychlost růstu než KM při 6% ethanolu (další soubor 1: obrázek S1).

k. marxianus evoluce v 6% (obj.) ethanolu. denní hodnota OD600 populace k. marxianus během evoluce. Buňky byly každý den přeneseny a subkulturovány do čerstvého média obsahujícího 6% (obj./obj.) ethanolu se stejným počátečním OD600 0,6. Poté po inkubaci při 30 °C v orbitální třepačce po dobu 24 hodin byl měřen OD600, aby se zaznamenal růst buněk. b skvrnitá analýza ředění pro toleranci ethanolu mezi pre-a postevoluce. KM a KM-100d buňky byly inokulovány na kapalném médiu ethanolem v jedné z koncentrací gradientu: 0, 1, 2,…, 11% (v / v) a inkubovány při 30 °C po dobu 3 dnů. Buněčná suspenze 10 OD600 z kapalného média byla 5krát sériově zředěna a spatřena na destičce YPD a kultivována při 30 °C po dobu 2 dnů. C růstové profily KM a KM-100d při různých koncentracích ethanolu. Červená křivka je pro KM-100d a černá je pro KM. Během měření růstového profilu byly KM a KM-100d prováděny v biologickém trojím vyhotovení

analýza DNA naznačují, že k. marxianus nemá žádnou změnu ploidy nebo kritických genů během adaptivní evoluce

abychom objasnili změny DNA v KM-100d, provedli jsme analýzu ploidy DNA a identifikaci mutací DNA. Během adaptivní evoluce se obsah DNA populace k. marxianus málo změnil (další soubor 1: obrázek S2); nedošlo tedy k žádné ploidické změně. Analýzou DNA-seq KM a KM-100d, které byly oba mapovány na referenční genom k. marxianus DMKU 3-1042, byla získána místa SNP mezi KM a KM-100d (další soubor 2). Z identifikovaných 57 SNP byly v populaci KM-100d dominantní pouze 4 lokality. Tři z nich jsou umístěny v kódující oblasti genů SAN1, YAP1 a KHT2; druhý je na 445 bp před ERG26. Místo 1324 SAN1 bylo mutováno z C Na T a následně byla odpovídající aminokyselina transformována z argininu na cystein. Nicméně, podle analýzy Pfam 32.0, tato mutace nespadá do žádné identifikované proteinové domény. Obě mutace v YAP1 a KHT2 jsou synonymní mutace bez změny proteinu. Výše uvedená zjištění naznačují, že změny v kontextu DNA zdaleka nestačí k podpoře takového zlepšení fenotypu v KM-100d, a k tomu musí přispět transkripční přeprogramování. Proto jsme dále provedli RNA-seq analýzu.

globální přepojení vyvolané 100denní evolucí

abychom důkladně porozuměli toleranci ethanolu, provedli jsme analýzu RNA-seq k porovnání genových expresí kvasinek KM a KM-100d, které rostly v médiích se 4% a 6% (v/v) ethanolem. Na základě růstových profilů (obr. 1c), bylo pozorováno, že růstová schopnost mezi KM-100d A KM měla maximální rozdíl při 48 h; proto byly odebrány vzorky při 48 h pro analýzu RNA-seq. Nastavení / log2ratio / ≥ 1 a hodnota p < 0.05 jako kritérium pro definování významných diferenciálně exprimovaných (DE) genů jsme provedli de genovou identifikaci v sedmi skupinách (obr. 2, označeno jako 1, 2, 3, 4, 5, 6, a 7, resp.). V každé skupině byla provedena de analýza podle šipky směřující k ovládacímu prvku. Další soubor 3 poskytuje hodnoty exprese a statistiky diferenciální exprese všech genů. Existuje globální výrazový rozdíl mezi KM a KM-100d, když oba rostly v médiu bez ethanolu (obr. 2 Skupina①). Kvasinky KM-100d mají 1342 genů s vyšší expresí než u kvasinek KM, zatímco pouze 188 genů má nižší expresi. V médiích se 4% a 6% (v/v) ethanolem jsou počty up-regulovaných genů v KM-100d výrazně sníženy na 415 (skupina②) a 453 (skupina③). Čísla regulovaných genů jsou však stále mnohem více než čísla s nižší expresí (104 a 182 genů). Tyto výsledky naznačují, že kvasinky KM-100d jsou transkripčně přepojeny aktivací velkého počtu genů. Návrh byl dále podpořen změnami exprese vyvolanými ethanolem v kvasinkách KM a KM-100d. Při indukci 4% a 6% (v/v) ethanolu mají KM kvasinky 1452 a 1465 up-regulovaných genů (skupiny ⑥ A⑦), zatímco kvasinky KM-100d mají pouze 631 a 596 up-regulovaných genů (skupiny ④ a⑤). Kromě toho jsme použili heatmap.2 software v balíčku R pro shlukování genů a skupin na základě hodnot log2ratio (další soubor 1: obrázek S3) a zjistil, že profil genové diferenciální exprese ve skupině ① je blízký profilu skupiny⑦. Dohromady si kvasinky KM-100d udržovaly mnoho expresních rysů indukovaných ethanolem, i když rostly v médiu bez ethanolu. Díky těmto vlastnostem je vyvinutá buňka adaptivnější na nadcházející stimulaci ethanolem, tj. kvasinky KM-100d nemusí aktivovat tolik genů jako KM.

Globální analýza dat RNA – seq v KM A KM-100d pod tlakem ethanolu. Na tomto obrázku jsme rozčlenili data RNA-seq pro analýzu genové diferenciální exprese. KM a KM-100d byly prezentovány v levé a pravé části a koncentrace ethanolu 0%, 4% a 6% (v / v) byly umístěny v řadách. RNA-seq dat byly rozděleny do sedmi skupin, označeny jako①,②,③,④,⑤,⑥, a⑦. V každé skupině, šipka ukazuje na ovládací prvek pro identifikaci diferenciální exprese, a červené číslice označují nahoru regulované číslo genu, zatímco zelené představují dolů regulované číslo

následně jsme v každé skupině provedli analýzu obohacení genové ontologie (GO) PRO de geny (další soubor 1: Obrázek S4), a zjistil, že obohacené GO termíny pokrývaly širokou škálu buněčných základních fyziologických procesů, včetně biogeneze ribozomu, biosyntézy aminokyselin,opravy DNA, zpracování RNA atd., ale není přímo relevantní pro odolnost vůči ethanolu. Proto jsme se v následujícím textu zaměřili zejména na cesty silně spojené s metabolismem a tolerancí ethanolu analýzou přidružených de genů (další soubor 4).

KM-100d zvýšené používání ethanolu

pro usnadnění ilustrace grafu byly hodnoty log2ratio zapojených de genů (další soubor 4) rozděleny do pěti intervalů: 1 ~ 2, 2 ~ 3, 3 ~ 4, 4 ~ 5, 5 ~ 6 (a výše), jak je znázorněno na obr. 3.

možné cesty spotřeby ethanolu v K. marxianus. Na tomto obrázku se ethanol spotřebuje jak v cytoplazmě (horní část), tak v mitochondriích (spodní část). Modro–šedý obdélník označuje zapojených genů a Skupin①,②,③,④,⑤,⑥, a ⑦ jsou v souladu s těmito definicemi v Obr. 2. Červená a zelená v čísle skupiny označují genovou regulaci nahoru a dolů. Intenzita barvy představuje stupeň změny genové exprese, korespondence barvy a hodnoty log2ratio je kvantifikována barevným pruhem v levém horním rohu obrázku

byl zkoumán rozdíl mezi KM a KM-100d ve spotřebě ethanolu. Jak je znázorněno na obr. 3, mohou existovat dvě cesty pro přímou konzumaci ethanolu a byly oba up-regulovány v KM A KM-100d, když čelily ethanolu (skupiny④,⑤, ⑥ a⑦). Jedním ze způsobů je cytoplazmatický ADH6, který katalyzuje ethanol na acetaldehyd, usnadněný NADP+. Druhým je mitochondriální ATF1, který podporuje esterifikaci ethanolu pomocí acetyl-CoA. Zejména v KM-100d pod tlakem ethanolu (skupiny ④ a⑤) byl YGL039W up-regulován tak, aby generoval více NADP+, a tak může dodávat více koenzymů pro přeměnu ethanolu na acetaldehyd, aby se snížila toxicita ethanolu. V mitochondriích byly pro KM vystavené stresu ethanolu (skupiny ⑥ a⑦) up-regulovány pouze C2E1P301 a ADH4. Zatímco v KM-100d, během procesu z ethanolu na aldehyd na acetát, C2E1P301, ALD4, ADH3, ADH4 a ALD6 byly všechny up-regulovány (skupina①). Výše uvedené změny naznačují, že KM-100d může získat novou schopnost zmírnit toxicitu ethanolu zvýšením spotřeby ethanolu. Teorie vysvětluje, že KM-100d provádí více než KM v médiu s ethanolem.

KM-100d zvýšená biosyntéza membránových lipidů, anti-osmotický tlak, antioxidační stres a skládání proteinů, aby odolaly stresu ethanolu

kromě toho, že je spotřebován, akumulovaný ethanol přímo ovlivňuje integritu buněčné membrány, mění vnitřní a vnější osmotický tlak, narušuje konformaci proteinů a indukuje generování reaktivních druhů kyslíku (ROS), což způsobuje vážné poškození kvasinkových buněk . V následujícím textu jsme analyzovali de geny v těchto drahách pro poškození způsobené ethanolem U K. marxianus (obr. 4).

schematický diagram pro anti-ethanol způsobil poškození v K. marxianus. V levé části tohoto obrázku akumulovaný ethanol v médiu vytváří osmotický tlak na kvasinkovou buňku a následně aktivuje osmotickou reagující dráhu. Ve střední části proniká environmentální ethanol do buňky a narušuje buněčnou membránu. V pravé části jsou lipidy buněčné membrány syntetizovány k opevnění a opravě poškozené buněčné membrány. Ve spodní části ethanol narušuje konformaci bílkovin a způsobuje oxidační stres, čímž se aktivují související senzory a cesty odezvy. Čísla skupin a barvy pro diferenciální expresi genu jsou v souladu s čísly na obr. 3

po vývoji řízeném ethanolem byla aktivována cesta reakce na stres alkoholu v KM-100d. ASR1 , který se při expozici ethanolu translokuje z cytoplazmy do jádra, a ETP1, který působí jako cytoplazmatický retenční protein s rolí v transkripční aktivaci genů proteinu tepelného šoku závislého na ethanolu, byly v KM-100d (skupina①) a částečně regulovány v KM-100D (skupiny ⑥ A⑦), což naznačuje, že i v médiu bez ethanolu může KM-100d připravit citlivé cesty pro výzvu ethanolu, stejně jako KMOVA odpověď na ethanol.

tvorba membránových lipidů hraje důležitou roli při udržování integrity buněčné membrány při stresu ethanolu . Nenasycené mastné kyseliny, klíčové složky struktury buněčné membrány, úzce souvisejí s tolerancí ethanolu . Znázorněno na obr. 4, od acetyl-CoA po biosyntézu nenasycených mastných kyselin až po inkorporaci do fosfolipidu byly zapojené geny PPT2, FAD2 a TAZ1 regulovány v KM-100d (skupina①), což naznačuje, že po evoluci může KM-100d již zvýšit biosyntézu nenasycených mastných kyselin a dodat více surovin pro biogenezi buněčné membrány. A down-regulace genů ACC1, TSC13, FAS1 v KM exponovaných v ethanolu (skupiny ⑥ a⑦) je v souladu s předchozí zprávou,která může odpovídat za slabou toleranci ethanolu k. marxianus před adaptivní evolucí.

velké množství genů spojených s biogenezí lipidů v buněčné membráně, včetně fosfoglyceridu, sfingolipidu a sterolu, bylo diferencovaně exprimováno za ethanolového stresu (obr. 4). Zejména geny podílející se na biosyntéze fosfoglyceridů byly obecně up-regulovány v KM-100d (Skupina①) A V KM-faced ethanolu (skupiny ⑥ A⑦), což naznačuje, že fosfoglycerid může být hlavní složkou buněčné membrány pro rezistenci na ethanol. Pro biosyntézu sterolů bylo mnoho genů (např. ERG9 a ERG7) down-regulováno ve skupinách ④ a ⑥ a několik genů bylo up-regulováno ve skupině ⑤ (např. ERG25) a skupině ⑦ (např. ERG26), což naznačuje, že biogeneze sterolů může být důležitá pro postavení se vysokému ethanolu, ale ne pro nízký ethanol. Kromě toho byly geny CCI1, ERG2 a ERG25, které se podílely na biosyntéze fosfoglyceridů a sterolů, regulovány pouze ve skupině⑤; to může být jeden z vodítek pro lepší výkon KM-100d než KM ve vysokém ethanolu.

vysoká koncentrace ethanolu v médiu způsobuje osmotické namáhání kvasinkových buněk . Jak je znázorněno na obr. 4, osmotické senzory plazmatické membrány (SLN1, OPY2 a SHO1) a geny (HOG1, SSK1 a SSK2) zapojené do následné citlivé dráhy byly všechny up-regulovány v KM vystavených nízkému ethanolu (skupina⑥) a individuálně up-regulovány v KM-100d (Skupina①), v KM-100d čelil ethanolu (skupiny ④ A⑤) a v KM čelil vysokému ethanolu (skupina⑦). Produkce glycerolu je hlavní cestou Pro s .cerevisiae odolávající osmotickému tlaku. Když KM a KM-100d čelily ethanolu, většina genů souvisejících s glycerolovou biogenezí byla regulována dolů. Výše uvedená zjištění naznačují, že před a po evoluci, k. marxianus vždy vylepšuje cesty pro snímání a přenos osmotických stresových signálů; jeho strategie pro odolávání osmotickému stresu se však nemusí spoléhat na výrobní cestu glycerolu, musí existovat i jiné způsoby.

buněčná stěna poskytuje dostatečnou mechanickou pevnost pro buňku, aby odolala osmotickému tlaku, a sekreční dráha nejen transportuje proteiny buněčné stěny ven, ale také přenáší lipidy na plazmatickou membránu, aby zpevnila membránovou strukturu; proto tyto dva procesy mohou být zodpovědné za anti-osmotický stres. Analyzovali jsme de geny v sekreční dráze a biogenezi buněčné stěny (další soubor 1: obrázek S5). Geny zapojené do sekreční dráhy a biogeneze buněčné stěny byly obecně up-regulovány v KM-100d (skupina①) a některé z nich byly také up-regulovány v KM exponovaných v ethanolu (skupiny ⑥ a⑦). To znamená, že KM-100d nejen udržoval up-regulaci v sekreční dráze Pro KM odolné vůči stresu ethanolu, ale také široce rozšířil aktivační rozsah sekreční dráhy, aby se připravil na útok ethanolem; zvýšení sekreční dráhy a tvorby buněčné stěny tedy může být novou strategií KM-100d vyvinutou pro snášení osmotického stresu způsobeného ethanolem. Na druhou stranu, pro KM A KM-100d vystavené nízkému ethanolu (skupiny ④ a⑥), mnoho genů v sekreční dráze bylo down-regulováno, což naznačuje, že aktivace sekreční dráhy nemusí být nezbytným způsobem, jak k. marxianus reagovat na nízký ethanol.

pro proti oxidačnímu stresu vyvolanému ethanolem (obr. 4), HYR1, který funguje jako senzor a převodník hydroperoxidového napětí, byl up-regulován v KM A KM-100d, oba vystaveny vysokému ethanolu (skupiny ⑤and⑦). Transkripční faktory reagující na oxidační stres SKN7 a STB5 byly up-regulovány v KM-100d (Skupina①) A V KM čelily vysokému ethanolu (skupina⑦). Pro antioxidační stres byly geny zapojené do systému superoxiddismutázy (např. MTM1 a PRX1) obecně up-regulovány v KM-100d buď exponované v ethanolu ,nebo ne (skupiny①, ④ a⑤). Pro thioredoxinový systém jsou geny (např., MXR1 a TRR1) byly up-regulovány v KM A KM-100d oba čelili ethanolu. Bylo také hlášeno, že Thioredoxin a jeho reduktáza zvyšují toleranci k. marxianus k více inhibitorům odvozeným od lignocelulóz . Pro glutaredoxinový systém byly geny GRX2 a GLR1 regulovány pouze v KM-100d vystavených vysokému ethanolu (skupina⑤). Pro biogenezi peroxizomu byly geny jako PEX6 a PEX7 up-regulovány v KM-100d (skupina①) a některé další geny (např. PEX3 a INP2) byly down-regulovány v KM A KM-100d, když čelily nízkému ethanolu (skupiny ④ a⑥). Z výše uvedeného vyplývá, že KM-100d může globálně posílit antioxidační schopnost.

pro zajištění správného skládání bílkovin pod tlakem ethanolu (obr. 4), transkripční faktor tepelného šoku HSF1 byl up-regulován v KM A KM-100d čelil nízkému ethanolu (skupiny ④ a⑥), řada genů souvisejících s chaperonem (např. Cpr4) down-regulované V KM čelí ethanolu nebyly down-regulované V KM-100d. Proto může KM-100d obecně zvýšit skládání bílkovin, aby zajistil stabilnější buněčné prostředí.

bylo hlášeno, že u s. cerevisiae byla akumulace trehalózy důležitá pro toleranci ethanolu, protože trehalóza fungovala jako kompatibilní rozpuštěná látka, aby se zabránilo přílivu přebytečných solí do kvasinkových buněk; mezitím byly ethanolem indukovány také geny podílející se na degradaci trehalózy, aby se upravila v optimální koncentraci . Pro K. marxiana (obr. 4), zjistili jsme, že geny podílející se na biosyntéze a degradaci trehalózy (např., NTH1 a TSL1) byly běžně up-regulovány, pokud byly léčeny nízkým obsahem ethanolu (skupiny ④ A⑥), ale nebyly genem up-regulovány v metabolismu trehalózy, pokud byly vystaveny vysokému obsahu ethanolu(skupiny ⑤ a⑦). To naznačuje, že v K. marxianus může být akumulace trehalózy zvláštní strategií pro zvládání nízkého ethanolu, ale ne pro vysoký ethanol.

diferenciální exprese 15 genů zapojených do výše uvedených cest tolerantních k ethanolu byly validovány RT-qPCR analýzou (obr. 5). Výrazy genů ve skupině ① (obr. 5a) byly obecně up-regulovány. Na druhé straně up-regulace genů ve skupině ④ (obr. 5d) a skupina ⑤ (obr. 5e) nebyla tak vysoká jako ve skupině ⑥ (obr. 5b) a skupina ⑦ (obr. 5c). Naše analýza potvrdila, že geny přispívající k toleranci ethanolu jsou kontinuálně aktivovány v KM-100d i po stažení ethanolového stresu. Kontinuální genová exprese může být užitečná pro stabilizaci intracelulárního prostředí a přínos pro růst buněk v nadcházejícím stresu.

RT-qPCR analýza genové diferenciální exprese KM a KM-100d v různých skupinách. KM-100d vs. KM v médiu bez ethanolu. To je pro DE genovou analýzu ve skupině①. b KM exponované v 4% (obj./obj.) ethanolu vs. KM v médiu bez ethanolu. To je pro skupinu⑥. C KM exponované v 6% (obj./obj.) ethanolu vs. KM v médiu bez ethanolu. To je pro skupinu⑦. d KM-100d vystaveno 4% (obj./obj.) ethanolu vs. KM-100d v médiu bez ethanolu. To je pro skupinu④. e KM-100d vystaveno v 6% (obj./obj.) ethanolu vs. KM-100d v médiu bez ethanolu. To je pro skupinu⑤. V každém vzorku, 18S byl použit jako vnitřní kontrola. Celková RNA byla izolována z buněk kultivovaných za 48 hodin v biologickém trojím vyhotovení

ověření zvýšené spotřeby ethanolu a odolnosti proti vícenásobnému namáhání v KM-100d

zkontrolovali jsme růst kvasinek KM a KM-100d v médiu YNB s různými zdroji uhlíku (obr. 6a). Kvasinky KM I KM-100d mají stejnou schopnost využívat glukózu jako jediný zdroj uhlíku. Avšak v přítomnosti 1% a 2% (v/v) ethanolu jako jediného zdroje uhlíku rostly kvasinky KM-100d lépe než kvasinky KM. Výsledek podporuje naši výše uvedenou hypotézu, že kvasinky KM-100d využívaly ethanol efektivněji než kvasinky KM.

test buněčného růstu na ethanolu a životaschopnosti a fermentaci buněk při vícenásobném namáhání. test růstu buněk KM a KM-100d na bázi glukózy nebo ethanolu jako zdroje uhlíku. Buněčná suspenze 10 OD600 byla pětinásobně sériově zředěna a spatřena na destičce YNB s glukózou nebo ethanolem jako jediným zdrojem uhlíku a kultivována po dobu 2 dnů, jak je znázorněno podél sloupců. test životaschopnosti B buněk KM a KM-100d při tepelném namáhání. Teploty jsou 30 °C, 37 °C, 40 °C a 45 °C. C test životaschopnosti buněk při oxidačním stresu. H2O2 byl použit jako oxidační stimul a jeho koncentrace jsou 0%, 0,04%, 0,06% a 0,08%. životaschopnost D buněk pod osmotickým tlakem. Vysoká sůl (NaCl)byla použita k vyvolání osmotického tlaku s koncentracemi 0 M, 0,5 M, 0,6 M a 0.7 m. e výtěžek ethanolu a využití glukózy v KM A KM-100d v základních okolnostech. f výtěžek ethanolu a využití glukózy při 45 °C. g výtěžek ethanolu a využití glukózy při 6% (obj./obj.) napětí ethanolu. h výtěžek ethanolu a využití glukózy při 8% (v/v) ethanolovém stresu. V podfiguře b–d jsou KM a KM-100d v prvním a druhém řádku. Buněčná suspenze 10 OD600 byla 5krát sériově zředěna a spatřena na desce YPD a kultivována po dobu 2 dnů. Kromě termické zkoušky se stanovenými teplotami byly všechny ostatní zkoušky provedeny při 30 °C. V podfiguře e–h představují levá osa y a pravá osa y zbytky glukózy v médiu (označeno černě) a produkce ethanolu (označeno modře)

na druhé straně, na základě obr. 4, KM-100d se může vyvinout odolnost vůči ethanolu způsobenému více namáháním současně, včetně osmotického stresu, oxidačního stresu a termického stresu (pro proteiny tepelného šoku užívané jako chaperony pro skládání bílkovin). Abychom vyhodnotili tolerance kvasinek k vícenásobnému namáhání, provedli jsme test životaschopnosti buněk pro různé teploty, oxidaci a osmotické tlaky (obr. 6b-d). 30 °C, 0% H2O2 a 0 M NaCl) chybí rozdíl životaschopnosti mezi kvasinkami KM a KM-100d. Za přítomnosti různých namáhání však kvasinky KM-100d vykazují výrazně lepší životaschopnost než kvasinky KM. Dále jsou výhody významnější, zatímco napětí se stalo vážnějším (obr. 6b-d). Očekávali jsme, že tolerance k vícenásobnému namáhání by mohly přinést nové vlastnosti kvasinek při výrobě ethanolu.

dále jsme zkoumali produktivitu ethanolu mezi kvasinkami KM a KM-100d při vícenásobném namáhání. Za základních okolností (30 °C a 0% ethanolu, obr. 6e), kvasinky KM a KM-100d jsou téměř stejné jak ve spotřebě glukózy, tak ve výrobě ethanolu. Kvasinky KM-100d však vykazovaly významné výhody za přítomnosti vysoké teploty (45 °C, obr. 6f) nebo více ethanolu (6% nebo 8%, obr. 6g, h); společné prostředí se obvykle stalo v pozdním stádiu fermentace. Provedli jsme analýzu RT-qPCR pro kvasinky KM I KM-100d fermentované v médiu 6% ethanolem při 48 h, 72 h a 120 h (obr. 7). Většina těchto genů tolerantních k ethanolu byla up-regulována v KM-100d ve srovnání s V KM, zejména v dřívějším stádiu (48 h)pro počáteční úpravu na ethanol (obr. 7). Abych to shrnul, up-regulací expresí genů tolerantních k ethanolu kvasinky KM-100d překonaly kvasinky KM ve stresovém prostředí se zvýšenými výtěžky ethanolu.

RT-qPCR analýza genových expresí v KM A KM-100d během fermentace. KM-100d vs. KM oba při 48 h ve fermentaci. b KM-100d vs. KM oba při 72 h ve fermentaci. c KM-100d vs. KM oba při 120 h ve fermentaci. V každém vzorku, 18S byl použit jako vnitřní kontrola. KM I KM-100d byly kultivovány v médiích s 6% ethanolem. Celková RNA byla izolována z buněk kultivovaných v biologickém trojím vyhotovení