Knock-down a knock-out geny

Gen knock-down
tato technika umožňuje redukci exprese jednoho nebo více anorganismu. K tomu může dojít genetickou modifikací nebo léčbou areagentem, jako je krátká DNA nebo RNA oligonukleotid, který má sekvencekomplementární gen nebo transkript mRNA.
pokud je změna genové exprese způsobena vazbou oligonukleotidu na mRNA nebo dočasnou vazbou na gen, vede to k adočasné změně genové exprese, která nemění chromozomální DNA, a výsledek je označován jako „přechodný knockdown“.
při přechodném knockdownu způsobuje vazba tohoto oligonukleotidu na aktivegen nebo jeho transkripty sníženou expresi. Vazba může nastat prostřednictvím blokování transkripce, degradace transkriptu mRNA (např. siRNA nebo RNase-h dependentní antisense), nebo blokováním translace mRNA, míst sestřihu před mRNA nebo štěpení nukleáz, které se používají pro zrání jiných funkčních RNA, včetně miRNA (e.g.by morpholino oligos).
nejpřímější použití přechodných knockdownů je pro učení o genu, kterýbyl sekvenován, ale má neznámou funkci. Tento experimentální přístup je známý jako reverzní genetika. Často se používají přechodné knockdownyve vývojové biologii, protože oligos mohou být injikovány do jednobuněčných zygot a budou přítomny v dceřiných buňkách injikované buňky.

RNA interference (RNAi) je prostředek k umlčení genů prostřednictvím degradace mRNA. Gen knockdowntato metoda je dosažena zavedením malých dvouvláknových interferencírna (siRNA) do cytoplazmy. Po zavedení do buňky, exogennísirna jsou zpracovávány RISC. SiRNA je komplementární k cílové mRNA, která má být umlčena, a RISC používá siRNA jako šablonu pro lokalizaci cílové mRNA. Poté, co se RISC lokalizuje na cílovou mRNA, je RNA štěpenabibonukleáza.
RNAi se používá pro genetickou funkční analýzu. Použití RNAi může být užitečné při identifikaci potenciálních terapeutických cílů, vývoje léků nebo jiných aplikací.

Gen knock-out
Geneknockout (KO) je genetická technika, při které je jeden z genů organismu nefunkční. Knockout organismy se obvykle používají ke studiu genové funkcezkoumáním účinku ztráty genu. Heterozygotní a homozygotní Kos: v první je vyřazena pouze jedna alela, ve druhé jsou obě dvě alely vyřazeny.

řízená tvorba KO začíná ve zkumavce plazmidem, bakteriálním umělým chromozomem nebo jiným konstruktem DNA apokračuje do buněčné kultury. Buňky jsou transfektovány Dnakonstrukce. Často je cílem vytvořit transgenní zvíře, které mázměněný gen.
pokud ano, embryonální kmenové buňky jsou geneticky transformovány a vloženy do časných embryí. Výsledná zvířata s genetickou změnou v jejich zárodečných buňkách pak mohou často projít vyřazením genu do budoucích generací.

konstruktje navržen tak, aby rekombinoval s cílovým genem, což se provádí začleněním sekvencí ze samotného genu do konstruktu.Rekombinace se pak vyskytuje v oblasti této sekvence v genu, což má za následek vložení cizí sekvence k narušení genu.
podmíněný knockout umožňuje deleci genu tkáňovým nebo časově specifickým způsobem. To se provádí zavedením loxp míst kolem genu. Tyto důsledky budou zavedeny do zárodečné linie stejným mechanismem jako aknock-out. Tato zárodečná linie pak může být zkřížena na jinou zárodečnou linii obsahující Cre-rekombinázu, což je virový enzym, který dokáže tyto sekvence rozpoznat, rekombinovat je a odstranit Gen lemovaný těmito místy.
protože rekombinace dna je vzácná událost, cizí sekvence zvolená pro podání obvykle zahrnuje reportér. To umožňuje snadný výběrbuněk nebo jednotlivců, u kterých byl knockout úspěšný. Někdy se Dnakonstrukce vloží do chromozomu bez požadované homologníkombinace s cílovým genem.

(Ivana Venezia)

KNOCKDOWN
Jedná se o techniku, při které se snižuje exprese genu. Tato redukcemůže být výsledkem modifikace DNA nebo z vazby oligonukleotidu buď na mRNA nebo na gen. V tomto případě je změna výrazu dočasná, takže mymluvte o přechodném knockdownu.
jedna z technik umožňujících přechodné vyřazení genu spočíváv použití Morfolino oligomerů. Staly se standardním knockdownove zvířecích embryonálních systémech, takže Morfolinooligos se často používají ke zkoumání role specifického transkriptu mRNA v embryu. Jeho molekulární struktura má DNA báze připojené k páteři methylenemorfolinových kruhů spojených fosforodiamidátovými skupinami. Morfoliny blokují přístup jinýchmolekul k malým (~25 bázím) specifickým sekvencím povrchů párovacích bází ribonukleové kyseliny (RNA). Protožez jejich zcela nepřirozených páteřních kostí nejsou Morfoliny rozpoznánybuněčné proteiny. Nukleázy donot degradují Morfoliny, ani nejsou degradovány v séru nebo v buňkách. Nebyly publikovány žádné zprávy o aktivování toll-like receptorů Morpholinos nebo vrozených imunitních odpovědí, jako je indukce interferonu nebo zánětlivá odpověď zprostředkovaná NF-kB.Není známo, že morfoliny modifikují methylaci DNA.
Morfoliny nespouštějí degradaci svých cílových molekul RNA, na rozdíl od mnoha antisense strukturních typů(např. Místo toho Morfolinosaktuje „sterickým blokováním“, váže se na cílovou sekvenci v RNA a inhibuje molekuly, které by jinak mohly interagovat s RNA.
Morfoliny mohou také modifikovat sestřih pre-mRNA nebo inhibovat maturaci a aktivitu miRNA.
Blokovánítranslace
navázaná na 5′ – netranslatedregion messengerové RNA (mRNA), Morfoliny mohou interferovat s progresí ribozomálního iniciačního komplexu z 5′ cap na startkodon. Tím se zabrání překladu kódovací oblasti cíleného přepisu (tzv.“knocking down“ geneexprese). To je užitečné experimentálně, když vyšetřovatelchce znát funkci konkrétního proteinu; Morfoliny poskytují vhodné prostředky k potlačení exprese proteinu a učení, jakže knockdown mění buňky nebo organismus.
modifikující sestřih před mRNA
Morfolinoscan interferuje s kroky zpracování před mRNA buď tím, že zabrání tomu, aby se Malé jaderné ribonukleoproteiny (snRNP) navázaly na své cíle na hranicích intronů na řetězci před-mRNA, nebo blokováním nukleofilní adeninové báze a zabránily jí ve vytváření struktury spojovacích lariatruktur, nebo narušením vazby regulačních proteinů spojů, jako jsou tlumiče spojů a zesilovače spojů. Zabránění vazbě snRNP U1 (v místě dárce) nebo U2 / U5 (v místě polypyrimidinu a akceptoru) může způsobitmodifikovaný sestřih, běžně vylučující exony z mRNA. Cílení na některé cíle spojování má za následek intronové inkluze, zatímco aktivace kryptických míst spojení může vést k částečným inkluz nebo vyloučení.Cíle U11 / U12 snRNPs mohou být také blokovány. Modifikace spoje může býtpohodlně testována reverzní transkriptázovou polymerázovou řetězovou reakcí (RT-PCR)a je považována za posun pásma po gelové elektroforéze produktů RT-PCR.
KNOCKOUT
variace tradičního knockoutu genu je podmíněný knockout genu.
podmíněný Gen knockout je technika používaná k eliminaci aspecifického genu v určité tkáni, jako je játra. Tato technika je užitečnástudovat roli jednotlivých genů v živých organismech. To se liší odtradiční Gen knockout, protože se zaměřuje na specifické geny v určitých časechspíše než odstranění od začátku života. Použití podmíněné geneknockout techniky eliminuje mnoho vedlejších účinků z tradiční Gen knockout. V tradičním knockoutu genů může dojít k embryonální smrti z genové mutace,což vědcům brání ve studiu genudospělých. Některé tkáně nemohou být studovány správně izolovaně, takže Gen musíbýt neaktivní v určité tkáni, zatímco zůstane aktivní v jiných. S tímtotechnologie, vědci jsou schopni knockout geny v určitém stádiu vvývoj a studovat, jak knockout genu v jedné tkáni ovlivňuje stejnégen v jiných tkáních.
nejčastěji používanou technikou je systém Cre-loxrecombination. CRE rekombinázový enzym specificky rozpoznává dvě lokusy (lokusy rekombinace) v DNA a způsobuje rekombinaci mezi nimi. Tato rekombinace způsobí deleci nebo inverzi genů mezi dvěma loxovými místy v závislosti na jejich orientaci. Anentire gen může být odstraněn nebo inaktivován. Celý tento systém je indukovatelný, takže achemický může být přidán k vyřazení genů v určitém čase. Dva z nejvícespolečně používané chemikálie jsou tetracyklin, který aktivuje transkripci genu rekombinázy a tamoxifenu, který aktivuje transport proteinu Crerekombinázy do jádra. Pouze několik typů buněk exprimuje Crerekombinázu a žádné savčí buňky ji exprimují, takže při použití podmíněného vyřazení genu u savců neexistuje riziko náhodné aktivace lox míst.
myš obsahující Gen Cre a myš obsahující sekvence loxP jsou chovány tak, aby generovaly podmíněný knockout pro konkrétní zajímavý gen. Myši přirozeně neexprimují CRE rekombinázu nebo loxsity, ale byly navrženy tak, aby exprimovaly tyto genové produkty, aby vytvořily žádoucí potomstvo. Musíte získat myš, ve které je floxován důležitý exon (to znamená, že má aLox-P proti proudu a po proudu) a myš, která má sekvenci Cre, jejíž exprese je regulována promotorem specifickým pro buněčný typ nebo indukovatelným promotorem. Pak tyto myši zkřížíte a získáte myš, ve které buňky, které neexprimují Cre, budou mít gen s normální funkcí, zatímco buňky exprimující Cre budou mít genovou funkci narušenou v části mezi Lox-P.
(Francesca Luca)

mechanismus interference RNA

RNA interference (RNAi), stará buněčná antivirová odpověď, je přirozeným mechanismem pro umlčení genové exprese. Může být využita k umožnění specifické inhibice funkce jakéhokoli genu. RNAi se ukazuje jako neocenitelný výzkumný nástroj, pomáhá při identifikaci nových genů zapojených do chorobných procesů.

RNAi není jediným mechanismemsilencování genové exprese (tabulka 1).

Tabulka 1: srovnání mezi různými způsoby umlčování genů.

k interferenci RNA (RNAi) dochází v reakci na zavedení dvouvláknové RNA (dsRNA) do buňky. Zavedení dsRna spouští aktivacidsrna-dependentní protein kináza-R (PKR). Aktivovaný PKR fosforyluje faktor iniciace translace EIF2: tento účinek ve spojení s aktivací Rnázy-L a indukcí produkce interferonu zastavuje syntézu proteinů a podporuje apoptózu. Celkově se předpokládá, že to představuje antivirový mechanizmus obrany. Rnaije vysoce konzervovaný mechanismus napříč taxonomickými druhy . Kromě tohomají antivirovou aktivitu, předpokládá se, že RNAi potlačuje expresipotenciálně škodlivé segmenty genomu, jako jsou transpozony, které by mohly jinak destabilizovat genom tím, že působí jako inzertní mutageny.

ačkoli jeho mechanismynejsou zcela objasněny, RNAi představuje výsledek vícestupňového procesu (Obrázek 1). Po vstupu do buňky jsou dlouhé dsrnanejprve zpracován enzymem Rnáza III Dicer. Tento funkční dimer obsahuje doménu elikázy, vazby dsRNA a paz (jejich role nejsou zcela objasněny). Dicer produkuje 21-23 nukleotidových dsRNA fragmentů s twonukleotidovými 3 ‚ koncovými převisy, tj. RNAi je zprostředkována RNA-indukovanýmsilencujícím komplexem (RISC), který, vedený siRNA, rozpoznává mRNA obsahující asekvenci homologní k siRNA a štěpí mRNA na místě umístěném aproximálně uprostřed homologní oblasti. Genová exprese je tedy specificky inaktivovaná na post-transkripční úrovni.

V C. elegans, Dicer byl ukázáninteragovat s proteiny rde. RDE proteiny se vážou na dlouhou dsRNA a jsou určeny k prezentaci dlouhé dsRNA na Dicer pro zpracování. Bylo hlášeno, že mutanti vykazující vysoký stupeň rezistence na RNAi mají mutace atrde-1 a RDE-4 lokusy.

Obrázek 1: mechanismus RNAi

výskyt doublestranded (ds) RNA v buňce (např. v důsledku virové infekce)vyvolává komplexní odpověď, která zahrnuje mimo jiné jevy (např.produkce interferonu a jeho důsledky) kaskáda molekulárních událostí známých jako RNAi. Během RNAi se buněčný enzym Dicer váže na dsRNA a štěpí se na krátké kousky ~ 20 párů nukleotidů v délce známé jako smallinterferující RNA (siRNA). Tyto RNA páry se vážou na buněčný enzym zvaný RNA-indukovaný tlumící komplex (RISC), který používá jeden řetězec siRNA k vázání na jednovláknové molekuly RNA (tj. Nukleázová aktivita RISC pak degraduje mRNA, čímž umlčí expresi virového genu. Podobně se předpokládá, že genetický aparát buněk totilizuje RNAi k řízení exprese endogenní mRNA, čímž se přidá nová vrstva post-transkipční regulace. RNAi může být využitexperimentální nastavení srazit cílové geny zájmu s highspecific a relativně snadné technologie (Viz text pro více informací).

kromě genesilencingu se RNAi může podílet i na dalších jevech genové regulace.. Zdá se, že RNAi může také fungovat methylací cytosinů a Cggsequences klasičtěji spojených s methylací. Pokud je cílová sekvence homologována s promotorem, může dojít k transkripčnímu umlčení viamethylací. Navíc se zdá, že RNA interaguje s chromatinovými doménami, což může nakonec vést k methylaci DNA. Studie C. elegans ukázaly, žernai se může šířit mezi buňkami prostřednictvím mechanismů, které nemusí záviset na siRNA.Sid-1 kóduje konzervovaný protein se sekvencí signálního peptidu a 11 domnělými transmembránovými doménami, což naznačuje, že protein Sid-1 může působit jako kanál pro dlouhou dsRNA, siRNA nebo v současné době neobjevený signál související s RNAi. Mutanti Sid-1 si zachovávají autonomní RNAi, ale neukazují šíření RNAi. Zůstává nejasné, zda se tato systémová RNAi vyskytuje u savců, i když je hlášena silná podobnost mezi Sid-1 a předpokládanými lidskými a myšími proteiny.

(Justine Floret)

zdroj : https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/1479-5876-2-39#Sec3

lang=“ en-gb “ xml:lang= „en-gb“>

ZFN, TALEN, CRIPR/CAS9

tyto tři molekulární technologie umožňují editovat genom specifickým způsobem, každá technika s jiným mechanismem. Nukleázy zinkových prstů (zfns) a efektorové nukleázy podobné transkripčním aktivátorům (TALENs) jsou chimérické nukleázy složené z programovatelných sekvenčně specifických modulů vázajících DNA spojených s nespecifickou doménou štěpení DNA. ZFNs a TALENs umožňují širokou škálu genetických modifikací indukcí zlomů DNA s dvojitým vláknem, které stimulují nehomologní koncové spojení náchylné k chybám nebo opravu zaměřenou na homologii na specifických genomických místech.

obrázek pořízený z http://gentaur-italy.com/prodotti/talen-un-sistema-semplice-e-veloce-per-gene-knockout/

univerzálnost Zfns a TALENs vyplývá ze schopnosti přizpůsobit doménu vázající DNA tak, aby rozpoznala prakticky jakoukoli sekvenci. Tyto moduly vázající DNA lze kombinovat s mnoha efektorovými doménami, které ovlivňují genomickou strukturu a funkci, včetně nukleáz, transkripčních aktivátorů a represorů, rekombináz, transpozáz, DNA Histon methyltransferáz a Histon acetyltransferáz. Schopnost úspěšně provádět genetické změny tedy do značné míry závisí na specificitě vázající DNA a afinitě navržených proteinů zinkových prstů a TALE.

cys2-His2 proteiny zinkových prstů

doména cys2-His2 zinek-prst patří mezi nejběžnější typy motivů vázajících DNA nalezených v eukaryotách a představuje druhou nejčastěji kódovanou proteinovou doménu v lidském genomu. Jednotlivý Zinkový prst se skládá z přibližně 30 aminokyselin v konzervované konfiguraci ββα. Několik aminokyselin na povrchu α-šroubovice se obvykle dotýká tří párů bází v hlavní drážce DNA, s různou úrovní selektivity. Modulární struktura proteinů zinkových prstů z nich učinila atraktivní rámec pro návrh vlastních proteinů vázajících DNA. Klíčem k aplikaci proteinů zinkových prstů pro specifické rozpoznávání DNA byl vývoj nepřirozených polí, která obsahují více než tři domény zinkových prstů. Tento pokrok byl usnadněn objevem vysoce konzervované linkerové sekvence založené na struktuře, která umožnila konstrukci syntetických proteinů zinku a prstů, které rozpoznávaly sekvence DNA 9 na 18 bps na délku. Protože 18 bps sekvence DNA může poskytnout specificitu v rámci 68 miliard bp DNA, tato metoda umožnila poprvé zacílit na specifické sekvence v lidském genomu.

transkripční aktivátory podobné efektorům

TALEs jsou přirozeně se vyskytující proteiny z rostlinných patogenních bakterií rodu Xanthomonas a obsahují domény vázající DNA složené z řady 33-35 aminokyselinových opakujících se domén, z nichž každá rozpoznává jeden bp. TALE specificita je určena dvěma hypervariabilními aminokyselinami, které jsou známé jako opakované proměnné diresidues (RVDs). Stejně jako zinkové prsty jsou modulární opakování příběhů spojeny dohromady, aby rozpoznaly souvislé sekvence DNA. Na rozdíl od proteinů zinkových prstů však nedošlo k přepracování vazby mezi opakováními nezbytnými pro konstrukci dlouhých polí příběhů se schopností teoreticky řešit jednotlivá místa v genomu. Kromě jejich role při usnadňování HDR (homologní přímá rekombinace) umožňují site-specifické nukleázy také rychlou generaci buněčných linií a organismů s nulovými fenotypy; NHEJ-zprostředkovaná Oprava NUKLEÁZOU indukované DSB vede k zavedení malých inzercí nebo delecí na cílovém místě, což má za následek vyřazení genové funkce prostřednictvím mutací s posunem rámce.

obrázek převzatý z http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/gma/nucleases.aspx

na rozdíl od místně specifických nukleáz popsaných výše se systém CRISPR (Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats)/CRISPR-associated (Cas) nedávno ukázal jako potenciálně snadná a účinná alternativa k ZFNs a TALENs pro vyvolání cílených genetických změn. U bakterií poskytuje systém CRISPR získanou imunitu proti invazi cizí DNA prostřednictvím štěpení DNA řízené RNA. V systému CRISPR/Cas typu II jsou krátké segmenty cizí DNA, nazývané „distanční vložky“, integrovány do genomových lokusů CRISPR a transkribovány a zpracovány do krátké CRISPR RNA (crrna). Tyto crrna se žíhají na transaktivační crrna (tracrrna)a přímé sekvenčně specifické štěpení a umlčení patogenní DNA proteiny Cas. Nedávná práce ukázala, že rozpoznávání cíle proteinem Cas9 vyžaduje sekvenci „semen“ v rámci crRNA a sekvenci chráněného dinukleotidu obsahujícího protospacer přilehlý motiv (PAM) před oblastí vázající crRNA. Systém CRISPR / Cas tak může být znovu zacílen tak, aby štěpil prakticky jakoukoli sekvenci DNA přepracováním crRNA. Významně se ukázalo, že systém CRISPR/Cas je přímo přenosný na lidské buňky současným dodáním plazmidů exprimujících Endonukleázu Cas9 a nezbytné složky crRNA.

snímek pořízený z https://www.computescotland.com/crisprcas9-genome-editing-8111.php