Kruppelův faktor 2 (KLF2) reguluje prozánětlivou aktivaci monocytů

výsledky

exprese KLF2 je snížena aktivací/diferenciací monocytů na makrofágy.

abychom lépe porozuměli roli KLF2 v regulaci imunitních buněk, jako jsou monocyty / makrofágy, nejprve jsme vyhodnotili expresi KLF2 v primárních lidských monocytech. Jak je znázorněno na obr. 1 a levá, klf2 exprese je robustní v primárních lidských monocytech a silně redukovaná s diferenciací na makrofágy po 5 dnech. Klf2 exprese v lidské monocytární buněčné linii THP-1 byla mnohem nižší než u primárních lidských monocytů. Exprese však byla dále snížena po ošetření těchto buněk LPS nebo 12-o-tetradekanoylforbol-13-acetátem, dvěma činidly dobře zavedenými pro indukci buněčné aktivace nebo diferenciace (obr. 1 A Právo).

dále jsme se snažili zjistit, zda je exprese KLF2 regulována v zánětlivém prostředí in vivo. Monocytární aktivace je klíčovou patofyziologickou událostí ve vývoji aterosklerózy, chronického zánětlivého stavu nízkého stupně, takže jsme usoudili, že exprese KLF2 může být u těchto pacientů snížena (11). Zkoumali jsme skupinu 14 normálních jedinců odpovídajících věku a 14 pacientů s rozsáhlou aterosklerózou (≈50% s anamnézou revaskularizace koronárních tepen), kteří jsou stratifikováni nejnižší a nejvyšší hladinou genu osteosarkomu Finkel–Biskis–Jinkins (FOS), u nichž bylo prokázáno, že slouží jako marker zánětu (12). Jak je znázorněno na obr. 1 B, exprese KLF2 byla u pacientů významně snížena o ≈30%. Naproti tomu u KLF3, KLF6, KLF11 a KLF13 nebyl pozorován žádný významný účinek. V souladu s naší předchozí studií byla exprese FOS významně zvýšena u pacientů s ischemickou chorobou srdeční (12).

KLF2 inhibuje aktivaci monocytů a fagocytární kapacitu.

v reakci na zánětlivé podněty monocyty exprimují zvýšené hladiny prozánětlivých faktorů a cytokinů/chemokinů a vykazují zvýšenou fagocytární kapacitu. Abychom získali vhled do role KLF2 ve funkci monocytů, provedli jsme studie nadměrné exprese. Buňky THP-1 byly infikovány buď kontrolním prázdným virem (EV) nebo KLF2 (Ad-KLF2) po dobu 24-48 h a poté stimulovány LPS po dobu 2 a 6 h. Jak je znázorněno na obr. 2 a, léčba buněk infikovaných EV pomocí LPS (25 ng/ml) vedla k robustní indukci cyklooxygenázy (COX)-2, tkáňového faktoru a monocytového chemoatraktantního proteinu (MCP)-1 mRNA. Naproti tomu tato indukce byla výrazně oslabena u buněk infikovaných KLF2 (obr. 2 A). Podobné účinky byly pozorovány také v buněčné linii myších monocytů J774a (údaje nejsou zobrazeny). Navíc nadměrná exprese KLF2 silně inhibovala sekreci různých cytokinů a chemokinů. Jak je znázorněno na obr. Nadměrná exprese 2 B, KLF2 oslabila indukci faktorů zprostředkovanou LPS, jako je CD40L (o 49,6%), zánětlivý protein makrofágů 1α (48,4%), zánětlivý protein makrofágů 1β (64,2%), IL-1β (55,0%), IL-8 (79,1%), TNF-α (50,2%) a MCP-1 (68,8%). Tento účinek byl specifický, protože nebyl pozorován žádný významný účinek na hladiny mnoha dalších relevantních růstových faktorů (tgfß1, růstový faktor odvozený od krevních destiček a faktor stimulující kolonie granulocytů/makrofágů), cytokinů/chemokinů (IL-4, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-1α a IFN-γ) nebo enzymů měnících matrici (matricové metaloproteinázy typu 1, 2, 3 a 9) (údaje nejsou uvedeny).

klasickou charakteristikou aktivovaného monocytu / makrofágu je fagocytóza. Abychom zjistili, zda nadměrná exprese KLF2 ovlivňuje fagocytární schopnost monocytů, nadměrně exprimovali jsme KLF2 nebo kontrolní (EV) v buňkách THP-1, stimulovaných LPS, a vyhodnotili jsme schopnost těchto buněk přijímat Texas červeně značené biopartikuly zymosan A. Jak je znázorněno na obr. 2 C, kontrolní buňky infikované virem požívaly biopartikuly zymosanu. Naproti tomu absorpce monocyty exprimujícími KLF2 byla výrazně snížena (obr. 2 C). Společně tyto údaje ukazují, že KLF2 může inhibovat sekreci monocytů cytokinů / chemokinů a fagocytózy.

KLF2 neinhibuje nábor monocytů.

dále jsme se snažili posoudit vliv KLF2 na funkci monocytů in vivo. V reakci na zranění nebo zánětlivý podnět se monocyty rekrutují z krevního řečiště do tkání. Nejprve jsme provedli studie k posouzení, zda byl nábor monocytů změněn expresí KLF2. Abychom minimalizovali přínos jiných typů buněk, použili jsme C. B-17-Scid-béžové myši, které mají nedostatek T, B a přirozených zabijáckých buněk. Tato zvířata (n = 5 na skupinu) byla poté podrobena ozáření celého těla a rekonstituována buňkami j774a adenovirálně infikovanými buď kontrolním virem (EV) nebo KLF2 pomocí injekce ocasní žíly (popsané v materiálech a metodách). Zvířata byla poté podrobena i. p. injekci thioglykolátu (silné chemické dráždivé látky, která indukuje nábor monocytů) a počet buněk pozitivních na GFP byl hodnocen o 48 hodin později průtokovou cytometrickou analýzou. Jak je znázorněno na obr. 2 C A D, KLF2 neinhiboval nábor monocytů GFP+ J774a do peritoneální dutiny. Ve skutečnosti jsme reprodukovatelně pozorovali, že zvířata transdukovaná KLF2 vykazovala významný nárůst buněk GFP +. Tyto údaje naznačují, že KLF2 neinhibuje, ale spíše zvyšuje monocytární nábor do zánětlivého místa.

KLF2 inhibuje zánět vyvolaný karagenanem.

po náboru a migraci do tkání monocyty vylučují cytokiny, chemokiny a růstové faktory, aby udržely zánětlivou odpověď. Jak je znázorněno na obr. 2 B, poznamenali jsme, že nadměrná exprese KLF2 oslabila zpracování několika cytokinů a chemokinů. Chcete-li zjistit, zda KLF2 ovlivňuje monocytární prozánětlivou funkci, použili jsme dobře zavedený model zánětu: injekce nožní podložky vyvolaná karagenanem. Bylo dříve prokázáno, že injekce této chemické látky reprodukovatelně indukuje zánětlivou odpověď charakterizovanou otokem tlapky (13-15). C. B-17-Scid-béžové myši (n = 4 na skupinu) byly ozářeny, jak je popsáno výše, rekonstituovány kontrolními nebo klf2 exprimujícími buňkami J774a a poté napadeny injekcí karagenanu do podložky pod nohy (popsané v materiálech a metodách). Objem tlapky byl stanoven pomocí hydroplethismometru upraveného pro malé objemy (Ugo Basile, Milán). Jak je znázorněno na obr. 2 F, zvířata infikovaná EV vykazovala zvýšení objemu tlapky o 17 ± 1,08-mm3 a 23,3 ± 3,05-mm3 po 1 a 2 h injekce karagenanu. Naproti tomu zvířata rekonstituovaná buňkami j774a exprimujícími KLF2 vykazovala pouze 6, 25 ± 0, 85-mm3 a 7, 5 ± 0, 95-mm3 zvýšení objemu tlapky po 1 a 2 h po injekci karagenanu (obr. 2 F). V souladu s tímto hrubým účinkem odhalila histologická analýza tlapek sníženou extravazaci tekutin, což vede k tvorbě otoků (obr. 2 G, šipky).

účinek KLF2 Knockdown na expresi zánětlivého genu.

k určení významu KLF2 v expresi monocytárních zánětlivých genů byly také provedeny malé interferující RNA (siRNA) zprostředkované knockdown studie. Jak je znázorněno na obr. 2 H, ve srovnání s neošetřenými (kontrolními) a nespecifickými buňkami ošetřenými siRNA, knockdown KLF2 (≈60% knockdown) v buňkách J774a vedl k indukci zánětlivých genů, jako je MCP-1, a mírnější účinek na hladiny exprese COX-2 a tkáňového faktoru. Tyto výsledky byly také ověřeny pomocí analýzy PCR v reálném čase (obr. 2 I).

KLF2 inhibuje aktivity promotoru NF-kB a AP-1.

KLF2 může silně inhibovat indukci MCP-1, COX-2 a tkáňového faktoru zprostředkovanou LPS (obr. 2 A). Je známo, že indukce těchto cílů prozánětlivými podněty je regulována transkripčními cestami, jako jsou NF-kB a AP-1. Usoudili jsme, že KLF2 může v zásadě inhibovat tyto cesty na více úrovních, jako je exprese, vazba DNA nebo indukce transkripční aktivity.

nejprve jsme se zaměřili na NF-kB vzhledem k jeho ústřední roli při zánětu. Nadměrná exprese KLF2 nezměnila jadernou akumulaci p65 nebo jaderné hladiny IkB kinázy (IKK) α a IKKy (obr. 3 A). Nadměrná exprese KLF2 navíc nezměnila kinetiku fosforylace nebo degradace IkB nebo cytoplazmatických hladin IKKa, IKKß a IKKy (obr. 3 B). V souladu s těmito pozorováními neovlivnil KLF2 vazbu NF-kB na DNA. Jak je znázorněno na obr. 3 C, léčba buněk infikovaných kontrolním virem (EV) LPS vyvolala jediné hlavní pásmo. Studie konkurence a supershift ověřily, že toto pásmo představuje NF-κΒ. Téměř identický vzorec vazby NF-kB byl pozorován u buněk s nadměrnou expresí KLF2. K posouzení, zda KLF2 může ovlivnit transkripční aktivaci zprostředkovanou NF-kB, byly provedeny testy genových reportérů. Jak je znázorněno na obr. 3 D, transfekce p65 reportérem NF-kB luciferázy plazmid indukoval transkripční aktivitu ≈11krát. Tato indukce byla silně snížena v přítomnosti KLF2, což naznačuje, že KLF2 inhibuje transkripční aktivitu NF-kB. Podobné účinky KLF2 byly pozorovány pro dráhu AP-1 (obr. 5 A-C, která je zveřejněna jako podpůrná informace na webových stránkách PNAS).

nábor faktoru spojeného s KOAKTIVÁTOREM CBP (PCAF) pomocí KLF2 jako sjednocujícího mechanismu.

dohromady výsledky na obr. 3 ukazují, že KLF2 může inhibovat transaktivaci zprostředkovanou NF-kB nezávisle na účincích na vazbu těchto faktorů na DNA. Jedním z možných mechanismů je nábor kritických koaktivátorů. Například optimální vazba NF-kB vyžaduje interakci s několika klíčovými koaktivátory, jako je koaktivátor steroidních receptorů (SRC) -1, PCAF a p300/CBP. KLF2 může interagovat s jedním nebo více z těchto faktorů, rekrutovat je od NF-kB a v důsledku toho snížit transkripční aktivitu zprostředkovanou NF-kB.

abychom určili roli PCAF v inhibici transkripční aktivity NF-kB zprostředkované KLF2, provedli jsme cotransfekční studie s exogenním PCAF. Transfekce PCAF (ale ne p300; údaje nejsou zobrazeny) významně zachránil klf2 zprostředkované represe NF-kB concatemer (obr. 4 A). Byla také pozorována částečná záchrana schopnosti KLF2 inhibovat transkripční aktivitu AP-1 (obr. 5D). Chcete-li zjistit, zda KLF2 a PCAF vzájemně interagují, provedli jsme GST pull-down a coimunoprecipitační testy. Pomocí in vitro transkribovaných a přeložených produktů jsme zjistili, že KLF2 a PCAF mohou interagovat přímo v systému bez buněk (obr. 4 B). Abychom věděli, zda se PCAF váže na KLF2 in vivo, přeexponovali jsme KLF2 (hemaglutinin-tagged) a PCAF (Flag-tagged) v buňkách COS-7. Imunoprecipitace protilátkou proti vlajce následovanou Western blotováním protilátkou proti hemaglutininu ukázala, že KLF2 se váže s PCAF v buňkách (obr. 4 C).

abychom zjistili, zda mechanismy, které jsou základem pozorovaných účinků, jsou funkční in vivo, provedli jsme studie chromatinové imunoprecipitace (ChIP). Jak se očekávalo, stimulace LPS buněk THP-1 vedla k náboru p65 a PCAF do promotoru COX-2 (obr. 4 D). Kromě toho byla pozorována souběžná acetylace HH3 a HH4. V souvislosti s nadměrnou expresí KLF2 jsou však nábor PCAF a acetylace histonu silně oslabeny (obr. 4 D). V souladu s našimi testy gel-shift nebyl pozorován žádný významný účinek KLF2 na nábor p65.