diskuse
pozorovaná produkce vysokých hladin proteázové aktivity během kontinuální kultury k. sedentarius usnadnil čištění dvou proteáz, P1 a P2, které byly účinné proti azokaseinu, β-řetězci inzulínu, keratinu extrahovanému z lidského kalusu a nezpracovaného kalusu. Obecné charakteristiky těchto enzymů včetně rozmezí substrátu, optimální teploty a pH a citlivosti na inhibitory proteázy naznačují, že jsou biochemicky podobné a pravděpodobně patří do rodiny alkalických serinových proteáz. Tyto proteázy jsou produkovány širokou škálou mikroorganismů a působí jako endopeptidázy (Rao et al . 1998).
zda mohou být enzymy také klasifikovány jako keratinázy, zůstává otázkou debaty. Keratinázy by podle definice měly být schopny hydrolyzovat čistý nativní keratin. Extrakce keratinu však může být dosažena pouze předchozí léčbou denaturačními činidly, aby se oddělila od ne-keratinových proteinů. Mechanické ošetření, jako je kulové mletí, má za následek štěpení disulfidových vazeb, díky nimž je protein náchylnější k proteolytickému trávení proteázami, jako je trypsin a proteináza K, které nejsou klasifikovány jako keratinázy (Noval a Nickerson 1959). Podobně bylo také kritizováno použití tepelně sterilizovaných substrátů v testech keratinázy, protože zahřívání může způsobit denaturaci keratinu.
ačkoli v této studii byl jako enzymový substrát použit jemně mletý kalus, supernatantní tekutina kultury byla účinná proti kouskům neporušeného kalusu. Proto, i když tyto dvě proteázy nejsou striktně keratinázy, degradují lidský kalus in vitro a existují určité důkazy, že k tomu dochází také in vivo (Nordstrom et al. 1987).
proteázy byly také klasifikovány jako Keratinázy v důsledku jejich aktivity na redukovaném keratinu, přičemž redukční činidla byla buď přidána do směsi enzymových testů, nebo použita během extrakce keratinu. Ačkoli keratinolytická aktivita řady kožních bakterií byla studována za použití „nativního“ keratinu jako substrátu, redukční činidlo, DITHIOTHREITOL (DTT), byl zahrnut do testovací směsi. Například, když byla studována zjevná aktivita Keratinázy ze Staphylococcus epidermidis v nepřítomnosti DTT, nebyla zjištěna žádná aktivita (Mikx a de Jong 1987). Podobně serinová proteáza z keratinů degradovaných Candida albicans, která byla extrahována ze stratum corneum lidských podešví s 8 mol l-1 močovinou v Tris-HCl a β-merkaptoethanolu (Hattori et al . 1984). V této studii P1 a P2 hydrolyzoval keratin, který byl extrahován z kalusu lidské nohy močovinou a β-merkaptoethanolem, ale co je důležité, byl také schopen degradovat neošetřený kalus.
stratum corneum a lidský kalus je složitá a stabilní struktura, jejíž hlavní složkou je keratin. Existuje 30 lidských genů pro keratin, z nichž 18 je exprimováno na kůži (Fuchs 1995). Shrnutí keratinové databáze ukázalo, že každý keratin má potenciální štěpná místa pro proteázy a Asp-Arg a Gly-Arg jsou nejčastější. Pokud jsou keratinová vlákna na těchto místech zpočátku rozbita, je možné, že k postupné degradaci těchto menších jednotek dochází v místech sekundárního štěpení, čímž vzniká velikostní rozsah peptidových fragmentů, jak ukazuje analýza proteázového útoku na keratiny extrahované z lidského kalusu. Výsledky uvedené na obr. 3b označují dvě pH optima pro aktivitu P2 degradující kalus. Jedním z možných vysvětlení je, že ve vzorku jsou dva enzymy. To se zdá nepravděpodobné, protože použitý vzorek enzymu byl vysoce vyčištěn, jak ukazuje stránka se stříbrným barvením (viz obr. 1, pruh 6). Nelze vyloučit možnost dvou enzymů degradujících kalus ve vyčištěném vzorku P2 s velmi podobnou mobilitou na stránce. Stejný vzorek byl však testován za použití stejných pufrů s azokaseinovým testem a při pH 10·2 byl detekován pouze jeden optimální pH. Alternativní vysvětlení je, že komplexní interakce kalus substrát / enzym při různých pHs je rovnováha enzymové aktivity a jemných konformačních změn substrátu, což vede k dvojímu pH optima.
toto šetření ukázalo, že k. sedentarius produkuje dvě extracelulární proteázy, které mají aktivitu degradující kalus. Byly stanoveny základní informace o jejich relativních molekulárních velikostech, jejich pi. Konvenční enzymové kinetické studie však nemohly být řešeny, protože přirozeným substrátem použitým v těchto experimentech in vitro byla komplexní směs polymerů nerozpustná ve vodě. Zvýšená enzymová aktivita P2 v přítomnosti 800 mmol 1-1 soli může být relevantní pro přežití mikroorganismu na lidské kůži, která má měnící se koncentraci soli v závislosti na aktivitě ekrinní žlázy určené rychlostí cvičení osoby a teplotami prostředí. Mechanismus (mechanismy) podílející se na účinku chloridu sodného nebyl zkoumán. Předběžně se navrhuje, že chlorid sodný může ovlivnit buď terciární strukturu enzymu a substrátu, nebo obojí, aby se zlepšil přístup aktivního místa enzymů ke specifickým místům štěpení substrátu.
nejjednodušší vysvětlení pozorovaných výsledků je, že v supernatantu kultury k.sedentarius existují dva enzymy degradující kalus, serinové proteázy, které také solubilizují lidský keratin přítomný v kalusu. Je možné, že k. sedentarius produkuje jednu proteázu, kódovanou jedním genem, a že autokatalytická nebo jiná proteázová aktivita produkuje dva enzymy různých molekulových hmotností. Alternativně existují dva geny kódující dva nezávislé a úzce příbuzné enzymy. Druhá hypotéza je podporována předchozí studií (Holland et al. 1992). Vzorky z kontinuální kultury k. sedentarius v ustáleném stavu při různých rychlostech ředění testovaných na stránce, a překryté kaseinem, ukázaly dva enzymy, jeden konstitutivní a druhý detekovaný při vysokých koncentracích při nízkých rychlostech ředění. Důležité je, že při rychlosti ředění poblíž µmax nebyl detekován. Stanovení N-terminální aminokyselinové sekvence polypeptidů P1 (21 zbytků) a P2 (15 zbytků) ukázalo, že jsou zcela odlišné. Tento výsledek, společně s informacemi z experimentu s kontinuální kulturou, by naznačoval, že enzymy jsou nezávisle kódovány.
výsledky tohoto šetření posílily hypotézu, že specifické proteázy k. sedentarius mohou odpovídat za degradaci kalusu charakteristického pro pitted keratolysis. Dosavadní důkazy také naznačují, že se jedná o dvě proteázy a že jsou aktivní v pH místa kůže, pH 6·3-6·9 (Marshall et al. 1988). Interpretace výsledků získaných z experimentů in vitro do prostředí in vivo může být zpochybněna, i když byl jako substrát použit lidský kalus. V ideálním případě by měly být odebrány biopsie lidské kůže včetně oblastí normální a vypeckované kůže. Přítomnost a umístění nebo nepřítomnost proteáz by pak mohla být stanovena histologickými technikami používajícími monoklonální protilátky jako sondy pro proteázy a k.sedentarius. Etický souhlas by však nebyl udělen pro biopsie z požadovaného místa, nosného místa nohy, od reprezentativního počtu lidí. Zapojení k. sedentarius do pitted keratytosis mechanismem produkce proteáz degradujících keratin nebylo formálně prokázáno. Neexistují však žádné důkazy vyvracející hypotézy a její důvěryhodnost byla posílena zde uvedenými výsledky. Byly předloženy silné důkazy in vitro, které zahrnují k. sedentarius a jeho extracelulární enzymy degradující kalus ve stavu pitted keratolysis. Při normálním pH pokožky a povrchové hydrataci bude produkce a aktivita těchto enzymů nízká, přičemž P1 bude aktivnější. Za okolních podmínek okluze a na špatném hygeinu se pH kůže pohybuje na neutralitu a mírně nad ní. Tyto podmínky upřednostňují P2. Oba enzymy jsou s největší pravděpodobností zachycující enzymy, umožňující k. sedentarius získat zdroje uhlíku a dusíku, malé peptidy, uzamčené v rezidentním a nerozpustném komplexním polymeru, keratin. V současné době není regulace produkce těchto enzymů známa, stejně jako jejich relativní příspěvky k degradaci kalusu in vivo. Kromě klinických důsledků mají keratinolytické proteázy pro komerční sektor značnou hodnotu, protože jsou užitečné v řadě průmyslových procesů, včetně degradace keratinového odpadu z drůbežího a kožedělného průmyslu (Shih 1993; Onifade et al . 1998). Vysoká keratinolytická aktivita k. proteázy sedentarius při relativně nízkých teplotách a pH ve srovnání s mnoha jinými proteázami představují potenciální aplikaci těchto enzymů v biotechnologickém průmyslu.
