Údržba a zásoby Zebrafish: Zebrafish (Danio rerio) byly zvednuty a uspořádány podle zavedených protokolů30.Použité transgenní linie byly Tg (kdr-l: ras-MCHERRY)s91631, Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf49532, Tg(fli1:myr-EGFP)ncv233, Tg(fli1:myr-MCHERRY)ncv134, Tg(fli1:Lifeact-mCherry)ncv733, Tg(fli1:GAL4FF)ubs37, Tg(UAS:EGFP-UCHD) ubs1835, TgBAC (pdgfrb:GFP)ncv2236 a Tg (kdrl:EGFP)s84337. Všechny pokusy na zvířatech byly schváleny Výborem pro institucionální péči o zvířata a použití v pobočce RIKEN Kobe (IACUC).
plazmidy a oligonukleotidy: Zebrafish marcksl1a, marcksl1b a fscn1a byly klonovány PCR z cDNA 1 DPF embryí pomocí klonovací sady NEB® PCR. Všechny výrazové konstrukce použité v této studii byly generovány klonováním Gateway® a / nebo klonováním in-Fusion® pomocí plazmidů z Tol2Kit38. Plazmidy s mutovanými Marcksl1a a Marcksl1b byly generovány pomocí Q5® Site-Directed mutagenesis kit (NEB). vektory obsahující shRNA byly konstruovány ligací sekvence shRNA mezi místy EcoRI a PmeI za promotorem U6 modifikovaného vektoru pEGFP-U639 (dárek od Zuoshang Xu, Addgene plasmid #19799). Cílová sekvence pro člověka MARCKSL1 je 5′ – GTGTGAACGGAACAGATGATG-3′. Scrambled shRNA sekvence 5′ – GAGTCATGGGTCAGTTATATG-3 ‚ byla navržena jako neshodná sekvence (podtržená) marcksl1 shRNA. Vektory obsahující myší Marcksl1, Marcksl1-S120A/T148A/T183A (Marcksl1-AAA)a Marcksl1-S120D/T148D/T183D (Marcksl1-DDD)subklonované do pEGFP-N1 (Clontech) 10 byly dary od Eleanor T. Coffey (University of Turku). Podrobné informace týkající se plazmidů a primerů použitých v této studii lze nalézt v doplňkových tabulkách 1 a 2.
izolace RNA a syntéza cDNA: Celková RNA byla izolována pomocí TRI činidla (epigenetika) a direct-zoltm RNA MicroPrep kit (Zymo Research) a cDNA byla syntetizována pomocí SuperScript III® First-Strand synthesis system (Invitrogen) podle protokolů výrobce.
mozaiková exprese konstrukcí a transgenních zebrafish linií: Expresní konstrukty založené na Tol2 (5-10 pg) byly současně injikovány do jednobuněčných embryí zebrafish s 50 pg mRNA Transpozázy Tol2 transkribované z noti-linearizovaného vektoru pCS-TP (dárek od Koichi Kawakami, Národní genetický Ústav, Japonsko) pomocí sady mMESSAGE mMACHINE SP6 (Invitrogen). Pro mozaikovou expresi transgenů byla embrya analyzována při 1 nebo 2 dpf po injekci. Pro generování linií Tg(fli1ep:myl9b-EGFP)rk25 a TG(fli1ep:EGFP-PLC1δPH)rk26 byla injikovaná embrya vychována dospělým a vyšetřena na zakladatele.
generace mutantů zebrafish marcksl1a a marcksl1b: mutanty marcksl1a byly generovány mutagenezí zprostředkovanou CRISPR / Cas9. Jediná vodicí RNA (sgRNA) zaměřená na druhý exon (Doplňkový obr. 4a) byl generován pomocí protokolu nezávislého na klonování40. Cas9 / sgrna RNP komplex byl sestaven těsně před injekcí a po 5 min inkubaci při pokojové teplotě 200 pg proteinu Cas9 (Invitrogen) a 100 pg sgRNA byly současně injikovány do jednobuněčného stadia TG(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;TG (kdr-l:ras-MCHERRY)s916 embryo. mutanty marcksl1b byly generovány MUTAGENEZÍ zprostředkovanou TALENEM. TALEN se zaměřil na první exon marcksl1b (Doplňkový obr. 4b) byl navržen pomocí Tal Efektorového nukleotidového Targeteru 2.0 (https: / / tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen-old) a byly sestaveny metodou Golden Gate. 41. TALEN repeat variable di-residues (RVD) byly klonovány do rciscript-GoldyTALEN vector (Addgene) a limitované mRNA pro každý talen byly in vitro transkribovány ze SacI-linearizovaných expresních plazmidů pomocí mMESSAGE mMACHINE T3 kit (Invitrogen). Jednobuněčný stupeň Tg (fli1ep: Lifeact-EGFP) zf495; Tg (kdr-l:embrya ras-mCherry) s916 byla mikroinjektována 200 pg RNA (100 pg každé levé a pravé talenové mRNA). F0 zakladatelé byli identifikováni outcrossing TALEN nebo CRISPR / Cas9 injekčně ryby s wildtype ryb a screening potomků pro mutace na 2 dpf pomocí T7 endonukleázy I (NEB) test (pro ryby TALEN injekčně) nebo Sanger sekvenování(pro CRISPR / Cas9 injekčně ryby). Stručně řečeno, genomová DNA byla izolována ze skupin pěti embryí metodou Hotshot42 a odpovídající genomové oblasti byly amplifikovány. Mutace byly hodnoceny přímým sekvenováním purifikovaných PCR produktů. F1 potomstvo pozitivní F0 byly zvýšeny do dospělosti a heterozygotní nosiče pro mutace byly identifikovány fin-ořezávání a rutinní genotypizace PCR analýzy pomocí stejných primerů.
během screeningu bylo identifikováno šest mutantních alel v marcksl1a a pět mutantních alel v marcksl1b (Doplňkový obr. 13). Alela rk23 obsahuje deleci 2-nt, která vede k posunu rámce po aminokyselině 51 a předčasnému zastavení kodonu na aminokyselině 56 po 5 aminokyselinách missense (Doplňkový obr. 4a, c). Alela rk24 obsahuje deleci 5-nt, která vede k posunu rámce po aminokyselině 13 a předčasnému zastavení kodonu na aminokyselině 17 po 4 aminokyselinách missense (Doplňkový obr. 4b, d). Z těchto důvodů považujeme marcksl1ark23 a marcksl1brk24 za nulové alely a zaměřili jsme naše vyšetřování na analýzy těchto mutantů.
živé zobrazování: embrya byla namontována v 0, 8% nízkotavné agarosy (Bio-Rad) v médiu E3 obsahujícím 0, 16 mg/mL Trikainu a 0, 003% fenylthiourea. Konfokální z-stohy byly získány pomocí obráceného konfokálního mikroskopu Olympus IX83/Yokogawa CSU-W1 vybaveného kamerou Zyla 4.2 CMOS (Andor). Snímky s jasným polem byly pořízeny na mikroskopu Leica M205FA. Obrázky byly zpracovány pomocí Fidži (NIH).
laserová ablace: laserové ablace byly provedeny pomocí 405 nm laseru (Andor) a modulu frappa (Andor) namontovaného na obráceném konfokálním mikroskopu Olympus IX83/Yokogawa CSU-W1 s objektivem Olympus UPLSAPO 60x/na 1.2 ponoření do vody. Při 51% výkonu laseru byly aplikovány tři sekvenční laserové ablace s dobou prodlevy 1000 µs.
Mikroangiografie: Mikroangiografie byla provedena u divokých embryí typu marcksl1ark23, marcksl1brk24 a marcksl1ark23;marcksl1brk24. Celkem byla 2 a 3 embrya dpf injikována 1-2 nl dextran tetramethyl rhodaminem nebo dextran fluoresceinem (MW = 2000 kDa, Invitrogen) v dávce 10 mg / mL a okamžitě zobrazena. Konfokální z-stohy byly získány s objektivem Olympus UPLSAPO 10×/na 0.4. K pokrytí celého embrya bylo několik oblastí zobrazeno a sešito pomocí pluginu pro šití ve Fiji43.
transplantace buněk: skupiny 15-25 dárcovských buněk z marcksl1ark23;marcksl1brk24 mutantní embrya v pozadí Tg (kdr-l:ras-mCherry)s916 byly odebrány z náhodné polohy v blastodermu a transplantovány do laterální okrajové zóny v blastoderm44 embryí příjemců divokého typu při 4,5–6 hpf. Extrakce a transplantace byly provedeny pomocí olejového mikroinjektoru CellTram® 4r (Eppendorf)s kapilárou z borosilikátového skla GC100-15 (Harvard Apparature Ltd) vytvořenou horizontálním stahovákem mikropipet P-87 (Sutter Instrument Co.) a MF-900 microforge (Narishige) získat‘ lžíce ‚ tvar hladký tip. Během transplantace embryí, kde jsou uchovávány v agarózových potažených Petriho miskách s 0,5 X E2 pufrem . U 2 dpf byla pro mikroangiografii a zobrazování vybrána embrya s Mcherry pozitivními ISV. Bylo provedeno celkem osm nezávislých transplantací.
chemické ošetření: Latrunculin B (Merck Millipore) se rozpustí v DMSO na 1 mg/ml a uchovává se při -20 °C.CK666 (SIGMA) se rozpustí v DMSO na 50 mM a uchovává se při 4 °C. všechny sloučeniny se zředí na požadovanou koncentraci v E3 pufru.
transfekce, siRNA-zprostředkovaný protein knockdown a smykový stres experiment: HUVECs (Lonza, C-2519A) byly kultivovány v EGM médiu (Lonza) a používány až do průchodu 4. Pro plazmidové transfekce byly buňky naočkovány v médiu Opti-MEM (Gibco)na 5,8 × 104 buněk / cm2 na poly-l-lysinu a želatinou potažené krycí vrstvy a transfektovány 2 µg plazmidu pomocí Lipofektaminu 3000 (ThermoFisher Scientific). Dvě hodiny po transfekci bylo médium Opti-MEM změněno na médium EGM bez antibiotik. Huvecs (7.9 × 104 buněk / cm2) byly transfektovány 20 nM siRNA za použití činidla DharmaFECT1 (Dharmacon). Transfekce se opakovala po 24 hodinách. buňky byly pěstovány dalších 24 hodin před úplnou extrakcí nebo fixací RNA. ON-TARGETplus human MARCKSL1 siRNA-SMARTpool (Dharmacon) byl použit k knockdown MARCKSL1. On-TARGETplus Non-target pool (Dharmacon) byl použit jako kontrolní siRNA transfekce. Buňky byly fixovány 4% PFA/PBS, permeabilizovány 0,1% Tritonem X-100 a obarveny 14 µM DAPI pro označování jader, Alexa 568-phalloidin (1:1000, ThermoFisher Scientific) pro vizualizaci F-aktinu a anti-ve-kadherinové protilátky (1:100, buněčná signalizace) následované anti-rabbit Alexa 488 sekundární protilátka (1: 1000, ThermoFisher Scientific) k označení EC křižovatek.
pro experimenty se smykovým napětím byl HPAEC (Lonza)kultivován v 1000-1500 buňkách / mm2 na 1% želatině potažené misce v médiu EGM-2 (Lonza)a použit před průchodem 9. Buňky byly vystaveny statickému nebo laminárnímu smykovému namáhání při 15 dyn / cm2 po dobu 0,5, 1 nebo 6 h za použití zařízení paralelního deskového typu 45, 46. Jedna strana průtokové Komory sestávala z 1% skleněné desky potažené želatinou, na které spočívaly Kultivované Hpaecy, a druhá strana sestávala z polykarbonátové desky. Jejich ploché povrchy byly drženy 200 µm od sebe teflonovým těsněním. Komora byla opatřena vstupem a výstupem pro kapalinu a vstup byl spojen s horní nádrží silikonovou trubicí. Výstup byl otevřen do dolní nádrže. Průtok byl poháněn válečkovým / trubkovým čerpadlem. Kapalina (médium EGM-2) prošla z horní nádrže průtokovou komorou do spodní nádrže. Průtok byl monitorován ultrazvukovým průtokoměrem doby průchodu (HT107, Transonic Systems) umístěným u vchodu a byl řízen změnou výškového rozdílu mezi horní nádrží a výstupem z průtokové Komory. Intenzita smykového napětí (τ, dynes/cm2) působící na EC vrstvu byla vypočtena pomocí vzorce τ = 6µQ/a2b, kde μ je viskozita perfuzátu (poise), Q je objem průtoku (ml / s) a a A b jsou rozměry průřezu průtokové dráhy (cm). Po expozici smykovým napětím byla pro qPCR izolována celková RNA.
kvantitativní PCR v reálném čase: qPCR byl proveden za použití 1 µL cDNA, generovaného ze 150 ng (HPAECs) nebo 500 ng (HUVECs) celkové RNA, v reakční směsi 10 µL obsahující 1X Luna Universal qPCR Master Mix (NEB) a 400 nM dopředný a zpětný primer. Reakce byly spuštěny na přístroji ABI Prism 7900HT ve čtyřnásobném vyhotovení. Data byla analyzována pomocí softwaru Rq Manager (Applied Biosystems) a relativní exprese mRNA MARCKSL1 byla vypočtena metodou 2−Δδct47 za použití GAPDH jako referenčního genu.
hybridizace celé montáže in situ: Celá hybridizace mount in situ byla provedena podle standardního protokolu48. Embrya byla fixována ve 4% PFA při 24, 48 a 72 hpf a permeabilizována 10 µg / mL proteinázy k. hybridizace byla provedena v pufru obsahujícím 5% dextransulfátu sodného (MW = 500 kDa) při 70 °C přes noc. Po stringentním promytí byly vzorky blokovány 2% blokujícím činidlem (Roche) v pufru kyseliny maleinové a inkubovány přes noc s anti-digoxigeninovou (DIG) protilátkou, konjugovanou s alkalickou fosfatázou (Roche, 1:5000) při 4 °C .embrya byla obarvena roztokem NBT/BCIP (Roche) v barvicím pufru. Embrya byla přes noc vyčištěna v 70% glycerolu a zobrazena pomocí mikroskopu Leica M205FA. Marcksl1a a marcksl1b dig-značené 1,2 kb dlouhé riboproby byly generovány z plazmidů kódujících cDNA plné délky pomocí MEGAscript SP6 nebo T7 kitů (Invitrogen).
sekvenování jednobuněčné RNA: ECs byly izolovány z transgenních embryí Tg(kdrl:EGFP)s843. Třídění buněk bylo provedeno pomocí FACSAriaII Cell Sorter (BD Bioscience). Jednobuněčná suspenze byla vložena do systému 10x Chromium a knihovny cDNA byly konstruovány pomocí Chromium Next GEM Single Cell 3 ‚ GEM, Library and Gel Bead Kit v2 (10x Genomics) podle protokolu výrobce. Knihovna byla sekvenována na sekvenceru Illumina HiSeq 1500 (Illumina, USA). Cell Ranger v2. 1 byl použit, aby se de-multiplex raw base call (BCL) soubory generované Illumina sekvencery do FASTQ souborů, provést zarovnání, počítání čárových kódů a UMI počítání. Sekvenační čtení byla mapována do sestavy genomu zebrafish (GRCz11, ensembl release 92). Další analýzy byly provedeny pomocí softwaru Seurat package49 v R (https://www.r-project.org). Expresní matrice byly nejprve filtrovány udržováním genů, které jsou exprimovány v minimálně 3 buňkách, a buněk, které exprimovaly minimálně 200 genů pro následnou analýzu. Buňky byly dále filtrovány výběrem buněk, které exprimují nízký obsah mitochondrií (<7%). Data byla poté normalizována pomocí funkce NormalizedData, která normalizuje genovou expresi pro každou buňku celkovou expresí.
kvantifikace průměru krevních cév: živé Tg (fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg (kdr-l:Ras-mCherry)s916 transgenní wildtype nebo marcksl1 mutantní embrya byla zobrazena na 50-52 hpf. Konfokální z-stohy byly získány s Olympus UPLSAPO 40× / NA1. 25 silikonový olej ponoření objektivem. Pro výpočty průměru DA a PCV bylo provedeno 4-5 měření mezi ISV podél prodloužení žloutku (ISV č. 10-14). Pro průměr ISV bylo provedeno průměrně 6 měření podél každého ISV (ISVs č. 10-14) mezi DA a DLAV. Měření byla provedena pomocí Fidži (NIH).
kvantifikace čísla ES a proliferace: Pro počítání čísla EC bylo 52 hpf wildtype, marcksl1ark23, marcksl1brk24 nebo marcksl1ark23; embrya marcksl1brk24 v pozadí Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916 fixována v 4% PFA a obarvena 3 µM DAPI. Konfokální z-stohy byly získány s Olympus UPLSAPO 40x / na 1.25 silikonový olej ponoření objektivem. Jádra byla počítána v každém ISV (ISVs č. 9-22) mezi DA a DLAV. Kvantifikovat mitotické ECs v ISV, wildtype nebo marcksl1ark23; marcksl1brk24 embrya v Tg (fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;TG (kdr-l:pozadí ras-mCherry)s916 byly fixovány ve 4% PFA při 30, 36 a 48 hpf, permeabilizovány v 1% DMSO/1% Triton X-100 a obarveny anti-fosfo H3 protilátkou (1:250, Merck Millipore) následované anti-rabbit Alexa 488 sekundární protilátkou (1:1000, Thermofisher Scientific) a 3 µM DAPI. Konfokální z-stohy byly získány s Olympus UPLSAPO 40x / na 1.25 silikonový olej ponoření objektivem. Mitotické buňky (pH3-pozitivní buňky) byly započítány do ISV na obou stranách embrya (ISV č. 9-22). ISV byly vizualizovány pomocí fluorescence mCherry. Byla detekována pouze jedna PH3-pozitivní buňka na ISV bez ohledu na polohu ISV. Během počítání jsme považovali EC v telofáze za jednu buňku. Pro počítání počtu divizí EC byly embrya wildtype nebo marcksl1ark23;marcksl1brk24 v pozadí Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;TG(kdr-l:ras-MCHERRY)s916 zobrazovány z 24 na 48 hpf v 6 min intervalech pomocí Imerzního cíle silikonového oleje Olympus UPLSAPO 30×/na 1.05. Počet buněčných dělení v každém ISV (ISV č. 11-15) byl kvantifikován.
kvantifikace hladin aktomyosinu v apikální kůře: živé Tg (fli1:Lifeact-mCherry)ncv7; TG(fli1ep:EGFP-PLCδ1PH)rk26 a Tg(fli1ep:myl9b-EGFP)rk25; TG (kdr-l:ras-mCherry)s916 embrya zebrafish byla zobrazena při 30-34 hpf pomocí cíle Olympus UPLSAPO 60× / na 1.2 ponoření do vody. Intenzita Lifeact nebo Myl9b podél apikální kůry a v cytoplazmě byla měřena pomocí Fidži. Byl vypočítán poměr průměrné kortikální a cytoplazmatické intenzity.
analýza tvaru buněk in vivo: jednobuněčné značení ECs v ISV bylo dosaženo mozaikovou expresí buď fli1ep: lynEGFP plasmidu u wildtype, marcksl1brk24 nebo marcksl1ark23;marcksl1brk24 mutovaných embryí nebo fli1ep:marcksl1b-EGFP plasmid v embryích divokého typu. Při 2 dpf byla provedena mikroangiografie a cévy byly zobrazovány s objektivem Olympus UPLSAPO 60×/na 1.2 pro ponoření do vody s optickým Z rovinným intervalem 0,25 µm. Analýza tvaru buněk ECs ISV byla provedena poloautomatickým způsobem pomocí skriptu ImageJ vyvinutého na zakázku v Pythonu, rozšíření metody popsané v ref. 50. Obrázky byly nejprve hrubě oříznuty, aby se snížily požadavky na následnou paměť, a byla vyplněna další metadata(Typ cévy a identifikátor embrya). Poté byl spuštěn samostatný skript pro promítání a rozbalení buněk z nádoby na 2D povrch. Krátce, oříznuté obrazy byly nejprve otočeny na základě typu nádoby, aby hrubě zarovnaly osu nádoby se směrem z v zásobníku obrázků, a kanál štítku fluorescenční mozaikové buňky byl vybrán pro projekci. K překonání problémů s automatizovanou segmentací cév v fluorescenčním kanálu krevního bazénu způsobeném proměnnými fluorescenčními strukturami pozadí a perfuzí dextran-rhodaminu ven z nádoby byla osa cévy identifikována ručním definováním polohy cévy přibližně každých 10 µm skrz zásobník obrazu a poté provedením spline a interpolace Catmull-Rom. Data byla poté transformována, aby se narovnala osa plavidla ve třech rozměrech. Dále byla zjištěna Poloha maximální intenzity v projekčním kanálu podél paprsků v 1° intervalech kolem osy cévy. Tato informace byla použita k promítání intenzity fluorescence do roviny, kde jsou osy umístěny podél osy nádoby a úhlové polohy, a mapovat vzdálenost od osy nádoby v každé poloze na promítané rovině. Buňka byla identifikována z promítaného obrazu pomocí vestavěné Intermodové metody ImageJ. Potom byly vypočteny délky oblouku reprezentované stranami každého pixelu přidruženého k buňce (\(l = \ frac{{2 \ pi rd^2}}{{360}}\), kde r je vzdálenost mezi pixelem spojeným s buňkou a osou nádoby a d je strana pixelu) a používá se ke generování měření plochy povrchu buňky a poměru stran.
analýza tvaru buněk In vitro: pevné HUVECs byly zobrazeny pomocí imerzního cíle silikonového oleje Olympus UPLSAPO 40×/na 1,25. Celkem bylo pořízeno 10-20 snímků z každého krycího skluzu pro kvantifikaci a analyzováno poloautomatickým způsobem pomocí skriptu ImageJ napsaného na zakázku. Vícekanálové z-stacky byly maximálně promítnuty a kanál ukazující značku GFP byl identifikován z metadat nástroje. Vestavěná metoda prahování Otsu ImageJ byla použita k oddělení buněk zájmu od pozadí; výsledné binární obrazy byly vyčištěny odstraněním oblastí menších než 105 µm2 a oblastí v kontaktu s hranicí zorného pole. Následný krok ručního zásahu umožnil uživateli volitelně modifikovat oblasti buněk, které jsou předmětem zájmu na základě tohoto binárního obrazu, aby oddělil chybně sloučené buňky nebo zahrnoval buňky, které byly vynechány operací prahování. Skript pak vypočítal oblasti a obvody pro každou návratnost investic do buňky. Kromě toho byl pro každou buňku vypočítán „index špičatosti“ na základě poměru obvodu buňky k obvodu odpovídajícího konvexního trupu a hodnota pro poměr stran buňky byla vypočtena jako poměr hlavní a vedlejší osy elipsy namontované na ROI buňky.
analýza membránového blebbingu: grafy týkající se membránového blebbingu byly generovány poloautomatickým způsobem pomocí zakázkového skriptu ImageJ. Pro každou zobrazenou membránu byl v každém časovém bodě vypočítán poměr mezi délkou obrysu okraje membrány a euklidovskou vzdáleností mezi koncovými body hrany. Z výsledné časové řady byly vypočteny spektrální hustoty výkonu Welchovou metodou51. Výkonová spektrální hustota byla poté zprůměrována v okně zájmu, definovaném empiricky jako charakteristická doba, po kterou se vytvořily bleby (0,04-0,06 Hz); tyto průměrné hodnoty byly porovnány mezi experimentálními (nadměrná exprese Marksl1b) a kontrolními podmínkami.
analýza dynamiky aktinu a myosinu II v blebs: Grafy týkající se dynamiky aktinu nebo myosinu v blebujících buňkách byly generovány poloautomatickým způsobem pomocí zakázkového skriptu ImageJ. Vícekanálové časosběrné z-stohy byly nejprve maximálně promítnuty podél dimenze z. Software pak automaticky identifikoval okraj bleb mezi dvěma uživatelem definovanými kotevními body ve všech časových bodech pomocí vestavěné metody Otsu prahování ImageJ běžící na kanálu Marksl1b-EGFP jako náhrada pro membránové značení. Po kroku kontroly kvality uživatele k zajištění přesné identifikace okraje bleb byl profil intenzity aktin/myosin-kanál podél okraje extrahován v každém časovém bodě a vykreslen proti času v kymografu. V každém časovém bodě byly extrahovány statistiky intenzity spolu s oblastí bleb, zde definovanou jako oblast promítaná z uzavřená okrajem a čára spojující body na obou stranách bleb nejdále od hrotu bleb podél osy kolmé k přímce spojující uživatelem definované kotevní body, a průměrná intenzita kanálu aktin/myosin a oblast bleb byly vyneseny proti času.
kvantifikace hustoty kortikálního aktinu a šířky svazku: Obrazy aktinu ve vysokém rozlišení v HUVECs byly získány pomocí olejové čočky Plan-APOCHROMAT 63x namontované na konfokálním mikroskopu Zeiss LSM880 vybaveném detektorem Airyscan a GaAsP. Přibližně 3 µm čtvercové oblasti v rámci každého pozorování byly náhodně vybrány a oříznuty typicky 8 optických úseků pokrývajících kortikální síť z těchto oblastí. Promítané obrazy podél osy Z oříznutých hromádek byly generovány projekcí maximální intenzity a podrobeny následujícímu postupu. Protože aktinová vlákna v obraze byla nejednoznačná a nebylo možné vyhodnotit celou síť, kvantifikovali jsme počet aktinových vláken v omezených oblastech jako hustotu aktinových sítí. To bylo provedeno nastavením skenovacích čar podél X – a Y – osy na každém 4 pixely, a hodnoty pixelů podél každé skenovací čáry byly podrobeny savitzky-Golay filter52 pro výpočet derivátů prvního řádu. Aktinová vlákna byla poté identifikována nalezením bodů nulového křížení, což jsou vrcholy intenzity skenovací linie. Počty vrcholů byly děleny počtem pixelů skenovací čáry (šířka nebo výška obrazu) a hustota vláken nad obrázkem byla vypočtena na základě průměru těchto hodnot.
pro kvantifikaci šířky aktinového svazku byly centrické linie aktinových svazků generovány nalezením nulových přechodových bodů derivátů prvního řádu vypočtených savitzky-Golayovým filtrem a následným použitím hilditchova řídnoucího algoritmu. Aby se vyloučila možnost, že větvení – nebo křížové body aktinových vláken ovlivňují měření, větvící body nalezené uvnitř skeletonizované linie byly odstraněny a segmentovány. Ortogonální osa k celkovému segmentu byla stanovena získáním vlastního vektoru, a fluorescenční intenzity byly vzorkovány podél ortogonální osy probíhající gravitačním středem segmentu pomocí interpolační metody Lanczos-5. Potom byl průměr vlákna určen šířkou oblasti, která vykazovala větší nebo rovnou polovině maximální intenzity uvnitř linie vzorkované podél ortogonální osy k celkovému segmentu.
Statistika: Statistická analýza byla provedena pomocí Prism 8 (GraphPad Software, Inc.). Velikost vzorku nebyla předem stanovena, experimenty nebyly randomizovány a vyšetřovatelé nebyli zaslepeni alokací během experimentů a hodnocení výsledků.
souhrn zpráv
další informace o návrhu výzkumu jsou k dispozici v souhrnu zpráv o výzkumu přírody, který je spojen s tímto článkem.
