pacienti s Intolerančními reakcemi na totální náhradu kolenního kloubu: kombinované hodnocení diagnostiky alergie, Periprostetické histologie a Periimplantační vzor exprese cytokinů

Abstrakt

provedli jsme kombinovaný přístup k identifikaci podezření na alergii na artroplastiku kolene (TKR): patch test (PT), Test transformace lymfocytů (LTT), histopatologie (Celkové hodnocení; T-A B-lymfocyty, makrofágy a neutrofily) a semikvantitativní analýza Periprostetických zánětlivých mediátorů založená na PCR v reálném čase (IFNy, TNFa, IL1-β, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL17 a TGFß). Analyzovali jsme 25 pacientů s TKR s dosud nevysvětlitelnými komplikacemi, jako je bolest, výpotek a snížený rozsah pohybu. Skládaly se z 20 pacientů s prokázanou senzibilizací kovů (11 s PT reakcemi; 9 pouze s LTT reaktivitou). Kontrolní vzorky byly od 5 komplikovaných pacientů s TKR bez senzibilizace kovů, 12 pacientů s OA před artroplastikou a 8 pacientů s PT bez artroplastiky. Byly pozorovány lymfocytární infiltráty a fibrotická (membrána typu IV) tkáňová odpověď byla nejčastější u pacientů citlivých na kov, například u 81% pacientů pozitivních na PT. Ten měl také výrazný periprostetický výraz IFNy. 8/9 pacienti s Revizní operací pomocí implantátů na bázi Ti potažených / oxinia hlásili úlevu od příznaků. Naše zjištění ukazují, že kombinace diagnostiky alergie s histopatologií a periprostetickým hodnocením cytokinů by nám mohla umožnit navrhnout lepší diagnostické strategie.

1. Úvod

náhrada kyčelního a kolenního kloubu jsou velmi úspěšné chirurgické postupy k obnovení kvality života u pacientů s osteoartrózou a odpovídajícím způsobem se míra implantace neustále zvyšuje . U podstatné části těchto pacientů však selhání implantátu vede k revizi implantátu. Nedávná recenze uvádí celkovou míru revize náhrady kolenního kloubu (TKR) 9, 5% v Německu a 8, 4% v USA za rok 2011 . Ve spektru podmínek vedoucích k selhání TKR lze nalézt nežádoucí účinky, ale role alergie je stále kontroverzní otázkou. Kožní alergie na kov je častá v běžné populaci, například přibližně 13% na nikl (Ni), 2% na kobalt (Co) a 1% na chrom (Cr). Opotřebení nebo koroze vede k expozici periimplantátu a systémového kovu (zejména Ni, Cr nebo Co) u pacientů s artroplastikou a odpovídajícím způsobem je hlášena prevalence citlivosti na kov u pacientů s selháním implantátu . S ohledem na celkovou náhradu kyčle, aseptické uvolnění bylo většinou přičítáno opotřebení makrofágům dominujícím reakci cizího těla jako základnímu mechanismu . Během posledního desetiletí se pozornost obrátila na roli přecitlivělosti při zánětu periimplantátu. Zejména u artroplastiky kov na kov byla popsána podskupina pacientů vykazující spíše periimplantační lymfocytární zánět jako potenciální elicitor selhání implantátu . Popsané histologické změny zahrnují difúzní, perivaskulární nebo lymfaticko-folikulární (lymfoidní) infiltraci lymfocytů a několika makrofágů, vysoké endotelové venuly a částečně tkáňovou nekrózu . Alergie na kovy jako přispívající faktor byla navržena pozorovanou vazbou mezi periimplantátovým lymfocytárním zánětem, reaktivitou náplasti na kovy a zvýšenou odpovědí na transformační test lymfocytů (LTT) na kovy u řady takových pacientů . Stále však existuje kontroverzní diskuse, do jaké míry alergie na kovy přispívá k“ zastřešujícímu pojmu “ nežádoucí účinky při artroplastice kyčle . Ve skutečnosti mohou pacienti alergičtí na kovy dobře tolerovat příslušné kovy obsahující implantát . Pokud jde o TKR, existují také zprávy o kožní alergii na kov zjištěné ve spojení s komplikacemi, ale dosud není dále zkoumáno, zda je taková alergie na kov zodpovědná za biologickou reakci. Jak vidíme pacienty s podezřením na intoleranci implantátu ve speciální ambulantní ambulanci, přemýšleli jsme, zda u řady pacientů s komplikovanou TKR může být potenciální citlivost na kov spojena s konkrétním periimplantačním histologickým obrazem a vzorcem exprese cytokinů. Abychom řešili potenciální klinický význam nálezů, dále jsme kontaktovali pacienty, abychom zjistili, zda mají z revizní chirurgie nějaký přínos, se zvláštním důrazem na možné použití“ hypoalergenních “ materiálů při revizní operaci.

cílem šetření tedy bylo lépe prokázat alergickou etiologii u komplikovaného TKR kombinací různých diagnostických kroků a hodnocením klinického významu nálezů v následném sledování.

2. Materiály a metody

2.1. Pacienti a kontroly

studie se zúčastnilo celkem 45 pacientů. Studii schválila Etická komise. Byly analyzovány následující skupiny pacientů.

25 pacientů s artroplastikou kolene (16 m, 9 f, 37-75 let) s TKR na bázi CoCrMo a komplikacemi, jako je uvolnění, opakující se výpotky a bolest, byli jejich ošetřující ortopedičtí chirurgové prezentováni naší ambulanci pro diagnostiku alergií, protože předchozí diagnostika neposkytla žádné známky problémových elicitorů, jako je malpositioning/malalignment, fraktura nebo infekce. Podle výsledků diagnostiky alergií byli tito pacienti dále zařazeni do tří skupin. Skupina I: 11 pacientů (pozitivní a LTT pozitivní test), skupina II: 9 pacientů (negativní a LTT pozitivní test) a skupina III: 5 pacientů(negativní a LTT negativní test).

studie zahrnovala 12 pacientů (1 m, 52-89 let; „OA-kontrolní skupina“) bez implantátu, ale degenerativní onemocnění kloubů / osteoartritida (OA) před artroplastikou kolena.

studie zahrnovala 8 pacientů (2 m, 53-75 let; „PT-kontrolní skupina“) bez implantátu, ale podstoupili patch test (PT) pro podezření na alergické kožní onemocnění. 6/8 měl Ni-PT reaktivitu, 2/8 neměl Ni-PT reaktivitu.

u 25 pacientů s TKR byla potenciální citlivost na kov hodnocena pomocí PT a LTT; dále byly získány vzorky periprostetické tkáně pro histologii, molekulární analýzu a mikrobiologii. Kromě toho bylo při ambulantní návštěvě získáno skóre WOMAC, aby bylo možné získat zpětnou vazbu o vnímání každodenní aktivity a bolesti u pacientů. U 12 pacientů s OA („kontrolní skupina OA“) byly v primární TKR získány vzorky tkáně pro histologii, molekulární analýzu a mikrobiologii. U 8 pacientů s „PT-kontrolní skupinou“ byly biopsie získány z 6 reaktivních Ni-PT a 2 ni-nereaktivních PT oblastí pro histologii a molekulární analýzu. Charakteristiky 45 pacientů jsou shrnuty v tabulce 1.

2.2. Patch Test (PT)

u 25 pacientů s TKR byla na zádech pacientů testována Evropská standardní řada 30 kontaktních alergenů včetně Co, Cr a přípravku Ni (Hermal, Reinbek, Německo) doplněná řadou kovových alergenů (Brial Allergen GmbH, Greven, Německo) a řada komponentů kostního cementu v případě cementované artroplastiky. Testovací přípravky byly aplikovány ve finnových komorách po dobu 2 dnů a reakce byly hodnoceny v den odstranění a 3 dny po aplikaci. U pacientů s testováním série kostního cementu bylo provedeno další čtení po 1 týdnu. Hodnocení kožních reakcí bylo doporučeno německou výzkumnou skupinou pro kontaktní dermatitidu.

2.3. Lymfocytární transformační Test (LTT)

mononukleární buňky periferní krve (PBMC) byly získány z heparinizované krve pacientů TKR centrifugací hustoty na Ficoll-Hypaque (Phadia, Freiburg, Německo). Buňky byly kultivovány v rpmi1640 médiu (Biochrom, Berlín, Německo) doplněné autologním sérem, glutaminem, antibioticko-antimykotickým roztokem a neesenciálními aminokyselinami. Všechny kultury byly provedeny ve čtyřnásobném provedení v 96 jamkových deskách (Nunc, Roskilde, Dánsko). Stimuly byly pan T-buněčný mitogen fytohemaglutinin (PHA) 2, 4 µg/mL, tetanový toxoid (TT) 5 µg/mL, NiSO4, CrCl3 a CoCl2 (7 koncentrací od do ) a kultivační médium samotné jako kontrola. Po 5 dnech byly buňky pulzovány 3H thymidinem přes noc a proliferace byla hodnocena začleněnou radioaktivitou. Stimulační index (SI) byl vypočítán poměrem průměrných počtů za minutu (cpm) stimulovaných a nestimulovaných kultur. SI > 3 byl považován za pozitivní.

2.4. Analýza Periimplantační tkáně

u 25 pacientů s TKR byly vzorky tkáně získány z nově vytvořené kloubní kapsle v době revize. Nejméně 2 sondy byly odeslány k mikrobiologickému hodnocení do Endoklinik Hamburg. Další dvě sondy byly zpracovány pro histologii a jedna sonda pro molekulární analýzu. U 12 pacientů s OA byly získány vzorky tkáně v okamžiku primární implantace artroplastiky pro histologii a molekulární analýzu, jak je uvedeno výše. 8 pacientů s „PT-kontrolní skupinou“ podstoupilo punch biopsii svých ni-PT oblastí na zádech po odečtení testu na D3. Každá sonda byla získána pro histologii a molekulární analýzu.

2.5. Histologické vyšetření

tkáně fixované formalinem byly zpracovány a obarveny hematoxylinem-eosinem. Imunohistologie byla provedena s protilátkami proti T-buněčným (CD3), B-buněčným (CD20), makrofágům (CD68 resp KP1) a neutrofilním (CD15) antigenům. Sekce byly mikroskopicky vyšetřeny a proporcionální distribuce tkáňových složek včetně makrofágů, difúzní nebo perivaskulární akumulace T – nebo B-lymfocytů a plazmatických buněk, jakož i celkový reakční vzorec vzorku tkáně byly semikvantitativně hodnoceny. Klasifikační skóre bylo podle Krenn et al. a v případě vzorků odvozených od pacienta TKR byla použita konsensuální klasifikace. Tato konsensuální klasifikace rozděluje vzorce reakce tkáně peri-implantátu na cizí těleso ovládané částicemi, jako je odpověď (Typ I), infekční typ ovládaný granulocyty (typ II), směs typů I a II (kombinovaný typ, typ III) a paucicelulární a spíše fibrotická reakce (Typ IV, indiferentní Typ).

2.6. Molekulární analýza

následující sondy byly získány v kapalině konzervující RNA pro následnou analýzu: od každého z 25 pacientů s TKR a 12 pacientů s kontrolou OA peri-implantátu a subkutánní tkáně (referenční) sondy; z kontrolní skupiny patchových testů 6 ni-PT-pozitivních sond a 2 sondy z Ni-nereaktivního testovacího místa (reference).

celková RNA byla izolována ze vzorku tkáně extrakcí fenol/chloroform a reverzní transkribována na cDNA použitím AMV reverzní transkriptázy. Exprese následujících cytokinů byla analyzována semikvantitativním RT-PCR ve světelném Cykleru: IFNy, TNF, IL1-β, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL17 a TGFß. Hodnota exprese byla stanovena ve srovnání s genem pro udržení domu EF1 – metodou ΔΔCt Schmittgenem a Livakem .

2.7. Srovnání před a pooperačního skóre WOMAC

v souladu s publikací Roos et al byl použit upravený systém skóre. . Od pacientů skupin I a II bylo k dispozici předoperační skóre kolene WOMAC, dále jsme kontaktovali pacienty po revizní operaci, abychom také získali (nejméně 6 měsíců po operaci) jejich pooperační informace o skóre WOMAC. Zvláštní důraz byl kladen na pacienty s revizí pomocí „hypoalergenního“ materiálu.

3. Výsledky a diskuse

alergie na kovové implantáty stále zůstává diagnózou vyloučení, se zpožděním diagnózy kvůli chybějícím kritériím specifickým pro onemocnění a potřebě kombinace různých diagnostických kroků. Proto jsou nejprve zpochybňovány různé elicitory komplikací při selhání TKR a alergie na kovový implantát je diagnostikována kombinací PT, LTT a histopatologie . Studie zde prezentovaná si klade za cíl podpořit zlepšení diagnostických nástrojů.

3.1. Diagnostika alergie

u 20 pacientů s citlivostí na kov vykazovalo 11 (skupina I) PT reakce na kovy (částečně vícenásobné reakce): 10 na Ni, 6 na Co, 2 na Cr a jeden z těchto 11 pacientů také vykazoval PT reakce na složky kostního cementu (na gentamicin a benzoylperoxid). V 6/11 byly k dispozici další údaje o LTT, které vykazovaly 5x Ni reaktivitu a 1 nereaktivní LTT. U zbývajících 9 pacientů (skupina II) s negativním PT na implantované složky, ale pozitivní LTT, jsme zjistili 9x LTT reaktivitu na Ni, 1x na Co. Tyto údaje jsou shrnuty v tabulkách 2-4. V několika studiích byla u pacientů s artroplastikou zjištěna zvýšená citlivost na kov . Ve větším měřítku by při porovnání 100 bez příznaků s 200 komplikovanými pacienty s artroplastikou mohl být takový zvýšený výskyt alergie na kovy—zejména na Ni—reprodukován . Většina údajů o podmínkách uvolňování kovů in vivo je odvozena od pacientů s artroplastikou kyčle. Lokální uvolňování Co a Cr je však pozorováno také u TKR a je hlášena příslušná systémová expozice pacientů . Kromě toho může být také pozorováno podstatné uvolnění Ni u pacientů s CoCrMo-artroplastikou . Převaha alergie na Ni u našich skupin pacientů tedy nemusí odrážet pouze relativní převahu alergie na Ni v běžné populaci. Na druhé straně mohou mít i pacienti bez příznaků s dobře provedenou artroplastikou kolena kožní alergii na implantované slitinové kovy . Tak, jak Granchi et al. v roce 2012 bylo uvedeno, že přítomnost citlivosti na kov nemusí znamenat mechanismus selhání implantátu na úrovni jednoho pacienta.

3.2. Histologické vyšetření

dále jsme přemýšleli, zda by analýza periprostetické tkáně pomohla rozlišit reakci hyperergické tkáně. Pro tento účel byly vybrány čtyři podmínky pro srovnávací analýzu vzorku tkáně. Například vzorky periprostetické tkáně byly získány od (1) 20 pacientů s TKR s komplikacemi a citlivostí na kov (skupiny I a II); (2) 5 pacientů s TKR s komplikacemi, ale bez citlivosti na kov (skupina III); (3) 12 pacientů s degenerativním onemocněním kolenního kloubu/osteoartritidou (OA-kontrolní skupina) při primární artroplastice; a (4) kožní biopsie, které byly provedeny v místech PT u 8 pacientů s PT (kontrolní skupina PT), z nichž 6 mělo pozitivní, ekzematózní PT reakci na Ni a 2 neměly PT reakci na Ni. Hodnocení periprostetické / (neo) tkáňové reakce tobolek bylo provedeno podle standardizované klasifikace konsensu, kterou původně publikovali Morawietz et al. v roce 2006 a revidován Krenn et al. . Kromě toho byl kladen důraz na přítomnost T-lymfocytů, B-lymfocytů, neutrofilů a makrofágů—a dále byly odeslány sondy pacientů skupin I, II a III k mikrobiologickému hodnocení. Bylo zjištěno několik neočekávaných zjištění: 9/11 pacienti ve skupině I a 6/9 pacienti ve skupině II měli pojivovou tkáň bohatou na kolagenová vlákna připomínající reakci periprostetické tkáně (Typ IV/neurčitý typ). A pouze 5 z 20 pacientů citlivých na kov mělo celkový obraz „typu indukovaného opotřebením částic“ s odpovědí ovládanou makrofágy. To je na rozdíl od obecného pozorování odpovědi většinou opotřebení částic / cizího těla, jako je tkáňový vzor při neúspěšné artroplastice a pouze 15% reaktivita reakce typu IV (fibrotická) ve vzorcích 370 analyzovaných morawietz et al. . U těchto 20 vzorků našich pacientů ve skupinách I a II nebyly žádné známky infekce. Přestože převládala paucicelulární reaktivita podobná „artrofibróze“, byla přítomnost lymfocytů zaznamenána v perivaskulární nebo rozptýlené distribuci(Obrázky 1(A) a 1 (b)). Naproti tomu z 5 pacientů bez citlivosti na kov vykazovali dva infekce a lymfocytární zánět byl pozorován pouze u jednoho z těchto pacientů. U pacientů s OA byly opět zaznamenány lymfohistiocytární infiltráty spolu s nepřítomností neutrofilů. Tato zjištění jsou shrnuta v tabulkách 2, 3 a 4. Obrázky 1 písm. a) A 1 písm.b) jsou reprezentativní histologické nálezy pacientů ve skupinách i a II. biopsie z Ni-indukovaných alergických náplastových testovacích reakcí byly charakterizovány perivaskulárními a někdy difúzními lymfohistiocytárními infiltráty spolu s epidermálními změnami typickými pro kontaktní alergii, jak je znázorněno na reprezentativním vzorku(Obrázek 2 písm. a)). Witzleb et al. spekuluje se, že perivaskulární nebo difúzní přítomnost (T-)lymfocytů v periprostetické tkáni může být interpretována jako hyperergická odpověď . Nicméně, von Domarus a spolupracovníci popsali infiltraci T lymfocytů jako běžný nález ve vzorcích tkání získaných asepticky uvolněných artroplastů kov-na-polyethylen. Dospěli tedy k závěru, že ani nekrobióza ani infiltrace T-lymfocytů by neměly být považovány za specifické pro reakci přecitlivělosti na kov.

(a)

(b)

(a)
(b)

Obrázek 1

(a) příklad perivaskulárního lymfocytárního infiltrátu; Skvrna CD3. b) příklad rozptýlených periprostetických lymfocytů; skvrna CD3.

(a)

(b)

(a)
(b)

Obrázek 2

(a) histologie náplasti test (PT) reakce na Ni vykazující perivaskulární t-lymfocytární infiltráty, rozptýlené eozinofily a epidermální“ spongiotické “ změny. (b) relativní exprese zánětlivého mediátoru v biopsii pozitivní PT reakce na Ni. Analýza založená na semikvantitativním RT-PCR v reálném čase.

3.3. Profil exprese cytokinů

vzhledem k částečně neprůkazným publikacím jsme se dále zajímali o to, zda by hodnocení exprese zánětlivého mediátoru mohlo zlepšit charakterizaci vzorce tkáňové odpovědi. Na obrázku 2(b) je znázorněn vzorec exprese cytokinové RNA akutní probíhající specifické kožní opožděné hypersenzitivní reakce na Ni. Hlavními nálezy jsou výrazná upregulace IFNy jako typického markeru Th1-odpovědi stimulující buněčnou imunitní odpověď a IL-2 indikující aktivaci a proliferaci T-buněk . Při hodnocení skupin pacientů s kovovou TKR s / bez citlivosti na kov a OA-kontrolní skupinou byla taková upregulace IFNy také zvláště viditelná u pacientů skupiny I, například TKR s komplikacemi a reaktivita náplasti na kovy. Z ostatních hodnocených mediátorů byla u pacientů s TKR exprese IL-2 výraznější ve skupině I a ve skupině pacientů s OA a expresi TGF-ß o něco více ve skupinách I a II. To platí také pro IL-6 (ve skupinách I a II) a jednoho pacienta ve skupině II(pacient s periprostetickou infekcí). Tyto další mediátory nejsou prokázány, protože došlo pouze k určitému individuálnímu zvýšení TNF u pacientů s OA, ale žádný významný rozdíl mezi různými skupinami. Zvýšený závazek linie TH1 se odráží zvýšenou expresí IFNy. Zde jsme zjistili výraznou upregulaci IFNy nejen typicky u ni-indukovaných PT reakcí, ale zejména také u pacientů s TKR skupiny I, což naznačuje jeho roli v progresi periprostetického onemocnění. Zajímavé je, že Jämsen a spolupracovníci nedávno uvedli, že našli rozptýlené CD3+ T buňky v interface tkáni asepticky uvolněné kyčelní artroplastiky s převládající makrofágovou odezvou na opotřebení částic. Ani kvantitativní PCR ani imunohistochemie však nemohly vykazovat významnou expresi mediátorů TH1 (jmenovitě IFNy) nebo TH2 (IL-4). Protože kromě IL-6 zejména TGF-ß může hrát ústřední roli při nástupu a přetrvávání periprostetické, kloubní fibrózy, analyzovali jsme zde jeho příslušnou expresi v různých vzorcích tkáně. Pozorovali jsme zvýšení exprese TGF-ß u pacientů TKR citlivých na kov s interindividuálními variacemi. Obrázky 3(a) -3 (c) shrnují tato zjištění.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

obrázek 3

(a) cytokinová exprese IFNy v tkáních 5 různých skupin pacientů; exprese cytokinů byla analyzována ve srovnání s genem EF-1 udržujícím dům a s kontrolní tkání pacientů metodou ΔΔCt; (Wilcoxon-Mann-Whitney-test provedený statistickým softwarem SPSS). (b) cytokinová exprese IL-2 v tkáních 5 různých skupin pacientů; exprese cytokinů byla analyzována ve srovnání s genem EF-1 udržujícím dům a s kontrolní tkání pacientů metodou ΔΔCt; (Wilcoxon-Mann-Whitney-test provedený statistickým softwarem SPSS). (c) exprese cytokinů TGFß v tkáních 5 různých skupin pacientů; exprese cytokinů byla analyzována ve srovnání s genem EF-1 udržujícím dům a s kontrolní tkání pacientů metodou ΔΔCt (Wilcoxon-Mann-Whitney-test provedený statistickým softwarem SPSS).

3.4. Srovnání před a pooperačního skóre WOMAC

19 z 20 pacientů TKR odpovědělo na naši žádost a dokončilo pooperační skóre WOMAC. 9 pacientů uvedlo, že při revizi byl implantován“ hypoalergenní “ TKR (8x povrchový povlak na bázi Ti, 1x implantát na bázi oxinia). 8/9 pacienti z tohoto přístupu profitovali, jak je znázorněno na obrázku 4. Zatím existují pouze kazuistiky nebo malé série pacientů týkající se potenciálního přínosu z použití“ hypoalergenní “ TKR . Tyto výsledky však zdůrazňují potřebu následných studií ve větším měřítku.

obrázek 4

WOMAC skóre před a po revizní operaci u 9 pacientů, kteří dostávali „hypoalergenní“ materiál (8x Titan, 1x oxinium). Systém skóre byl použit v souladu s publikací Roos et al. .

ve studii však existují omezení: fakta, že vzorky periprostetické tkáně mohou odrážet pouze skutečnou fázi dynamického procesu a že pacienti s OA nemusí být tak dobře „kontrolou“jako tkáňové sondy rozhraní od pacientů s dobře fungujícími implantáty a omezený počet vzorků v tomto vyšetřování. K ověření multimodulárního diagnostického přístupu v alergii na kovové implantáty jsou tedy zapotřebí další studie.

4. Závěry

tato studie poprvé demonstruje potenciál využití kombinovaných analytických kroků k poskytnutí přístupu k rozvoji diagnostických charakteristik alergie na kovové implantáty. Diagnostika alergie (PT a LTT) a periprostetická histologie poukazují na imunologickou odpověď na implantované slitinové kovy a vzorec exprese zánětlivého mediátoru přispívá k funkční diferenciaci.

neočekávanými nálezy byla převládající“ fibrotická “ odezva rozhraní typu IV u pacientů s TKR senzibilizovaných kovem a výrazná exprese IFNy u pacientů s TKR pozitivních na PT.

střet zájmů

autoři prohlašují, že neexistuje žádný střet zájmů ohledně zveřejnění tohoto příspěvku.

poděkování

tato studie byla podpořena grantem endo-Stiftung, Hamburg a Grantem B Braun-Aesculap, Tuttlingen a Ludwig-Maximilians-University of Mnichov.