Delece KDM6A, histonové Demetylázy interagující s MLL2, U tří pacientů s Kabuki syndromem | Jumbuck

hlavní Text

Kabuki syndrom (KS; MIM 147920) byl poprvé popsán v roce 1981 Niikawa a Kuroki, 1, 2 a více než 400 případů bylo hlášeno v literatuře. Hlavními klinickými charakteristikami jsou charakteristické rysy obličeje, vývojové zpoždění, mírné až střední mentální postižení, postnatální retardace růstu, a další funkce včetně kosterních anomálií, hypodontie, a přetrvávající podložky prstů plodu. Srovnávací genomická hybridizace (CGH) microarray analýza nezjistila opakující se anomálii u 72 KS jedinců.3-8 použití strategie sekvenování exomu nedávno vedlo k identifikaci mutací MLL2 (mim 602113) jako hlavní příčiny KS.9 v pěti nedávno publikovaných sériích byly mutace v MLL2 nalezeny u 56% -76% pacientů s KS.9-13

protože významná část pacientů nemá detekovatelnou mutaci MLL2, předpokládali jsme existenci dalších genů spojených s KS. Při hledání další genetické mutace způsobující KS, deset genů interagujících s MLL2 bylo vyšetřeno u 15 jedinců KS negativních na mutaci MLL2 a nebyly identifikovány žádné patogenní mutace.11 další gen kódující protein interagující s MLL2, KDM6A (dříve známý jako UTX; MIM 300128), byl vyšetřen u 22 jedinců KS negativních na mutaci MLL2 a opět nebyly detekovány žádné kauzativní mutace.13

pomocí analýzy pole CGH (Agilent platform 244K) jsme identifikovali de novo Xp11. 3 mikrodelece u dvou belgických KS dívek s mutací MLL2 (pacienti 1 a 2). Protože obě delece byly de novo, jsou pravděpodobně patogenní. Obě delece zahrnovaly buď část nebo všechny KDM6A. navíc nebyly zjištěny žádné delece KDM6A v kohortě 411 normálních kontrol v předchozí studii.14 delece u pacienta 1 zahrnovala exony KDM6A 21-29, které kódují koncovou část katalytické domény KDM6A, a CXorf36, Gen nedávno zapojený do autismu spojeného s X.15 u pacienta 2 byly KDM6A, CXorf36, DUSP21 (mim 300678) a FUNDC1 (Obrázek 1) zcela odstraněny. Funkce DUSP21 a FUNDC1 zůstávají neznámé.

Region Xp11. 3 zobrazující delece pacientů

Region Xp11.3 zobrazuje delece odebrané z prohlížeče genomu UCSC (GRCh37/hg19) pro pacienty 1, 2 a 3. Černé plné stopy představují vymazání každého pacienta a číslo každého pacienta je nad jeho příslušnou stopou. Delece u pacienta 1 zahrnuje 283,5 kb od základny 44,941,324 do základny 45,224,829, delece pacienta 2 zahrnuje 815.7 kb od základny 44,377,858 do základny 45,193,629 a odstranění pacienta 3 zahrnuje 45,4 kb od základny 44,866,302 do základny 44,912,718. Geny v oblasti jsou zaznamenány pod delečními stopami. CNV v databázi genomických variant jsou uvedeny na spodních řádcích. Neexistují žádné předchozí zprávy o změnách počtu kopií KDM6A.

poté jsme sekvenovali KDM6A sangerovým sekvenováním a hledali intragenní delece nebo duplikace s cíleným vlastním agilentním polem CGH v kohortě 22 mll2-mutace-negativní KS jedinci (8 žen, 14 mužů). V souladu s etickými standardy Etické komise Institut de patologie et de Génétique byl získán souhlas rodičů pro analýzu DNA všech účastníků této studie a pro zveřejnění fotografií. Data CGH microarray (doplňková data, dostupná online) diskutovaná v této publikaci byla uložena v Národním centru pro biotechnologické informace (NCBI) genová exprese Omnibus (GEO)16 a jsou přístupná pod přístupovým GSE32567 (viz část přístupová čísla).

nebyly zjištěny žádné bodové mutace, ale identifikovali jsme de novo intragenní deleci (exony 5-9)u jednoho italského, mužského KS jedince (pacient 3). Také jsme sekvenovali UTY (MIM 400009), paralog Y chromozomu KDM6A (viz níže) a hledali intragenní delece nebo duplikace, jak je uvedeno výše, ale nezjistili jsme žádné mutace.

pacienti 1 a 3 měli typický KS fenotyp, včetně dlouhých palpebrálních trhlin, laterální everze dolního víčka a středně závažného až závažného mentálního postižení (Tabulka 1 a Obrázek 2). Ačkoli rysy obličeje pacienta 2 nebyly tak klasické, vykazovala mnoho rysů této poruchy, včetně laterální řídkosti obočí, dlouhé řasy, strabismus, dlouhé palpebrální trhliny, velké a prominentní uši, přetrvávající podložky prstů plodu, aortální koarktace, areolární plnost v dětství, a hirsutismus. Vykazovala mírné vývojové zpoždění a měla normální skóre kvocientu verbální inteligence (IQ), špatné skóre IQ a hyperaktivní chování (Tabulka 1 a Obrázek 2). Poznamenali jsme, že pacienti 1 a 2 měli dlouhé halucy (obrázek 3).

vzhled obličeje u postižených jedinců

(a) pacient 1.

(B) Pacient 2.

(C) Pacient 3.

Všimněte si dlouhých palpebrálních trhlin u pacientů 1 a 2 a klenutého obočí u pacientů 1 (mírných) a 3.

vzhled nohou u postižených jedinců

(a) pacient 1.

(B) Pacient 2.

Všimněte si dlouhých halucin u obou pacientů.

delece KDM6A u těchto tří pacientů jsou tedy spojeny se širokým fenotypovým spektrem od typických jedinců KS (pacienti 1 a 3) po mírnější klinickou prezentaci (pacient 2). Tato klinická variabilita je také znakem pacientů s mutacemi MLL2.13 je však třeba zvážit možné účinky delece CXorf36 u pacienta 1 a delece CXorf36, DUSP21 a FUNDC1 u pacienta 2 na jejich příslušné fenotypy.

KDM6A (29 exonů) je jedním z chromozomálních genů X, který do značné míry uniká inaktivaci X.17 kóduje 1,401 reziduálního proteinu, který obsahuje dvě funkční domény. Katalytická doména je histonová demethyláza, která specificky katalyzuje demethylaci mono -, di-a trimethylovaného lysinu 27 na histonu H3 (H3K27).18,19 tato demethylace zprostředkovává tkáňově specifickou expresi různých genů a je většinou zapojena do vývojových procesů a buněčného cyklu.19-22 je zajímavé, že KDM6A a MLL2 působí společně v epigenetické kontrole transkripčně aktivního chromatinu působením proti proteinům Polycomb-group (PcG).22 další funkční doména KDM6A hraje roli v remodelaci chromatinu interakcí s remodelačním komplexem SWI / SNF, který obsahuje transkripční aktivátor Brg1. 23

stejně jako MLL2 hraje KDM6A roli v embryogenezi a vývoji. Homozygotní dUTX (Drosophila KDM6A ortholog) mutanti Drosophila projevují drsné oči, dysmorfní křídla a modifikaci pohlavních hřebenů.21 tento fenotyp se podobá fenotypu trithoraxu, což dále podporuje představu, že KDM6A působí proti represi PcG.21 navíc UTX-1 (C. elegans KDM6A ortholog) může ovlivnit rozhodnutí o vývoji osudu v buňkách vulválního prekurzoru C. elegans prostřednictvím transkripční regulace genů, které kódují proteinový komplex retinoblastomu (RB), který byl konzervován od červů k lidem.20 Kdm6a1 je také důležité při expresi zadních genů Hox u Zebrafish.19 kromě toho KDM6A spolu s MLL2 hraje hlavní roli v regulaci svalových specifických genů během embryogeneze.22,24 konečně členové další důležité rodiny vývojových genů (geny T-boxu, které působí v mezodermu při tvorbě srdce a obratlů) rekrutují KDM6A k aktivaci svých cílových genů, opět zdůrazňují roli KDM6A ve vývojových procesech.23 je zajímavé, že většina patogenních mutací pro hlášené geny T-boxu u lidských chorob je umístěna v doméně T-boxu, která interaguje s KDM6A.23

KDM6A uniká inaktivaci X, 17 ale bylo navrženo, že u myší je exprese Kdm6a z neaktivního chromozomu X významně nižší než exprese z aktivního chromozomu X.25 exprese Kdm6a je vyšší u dospělého mozku, dospělých jater a specifických rozvojových oblastí mozku u žen než u mužů.25 UTY je paralog KDM6A na chromozomu Y.17 UTY má 84% aminokyselinovou sekvenci podobnost s KDM6A a může kompenzovat zvýšenou expresi KDM6A u žen, a to navzdory skutečnosti, že aktivita demethylázy musí být pro tento PARALOG KDM6A dosud prokázána.14,25

není překvapivé najít jiný gen spojený s KS na chromozomu X, protože byly hlášeny případy pacientů podobných KS s malými kruhovými chromozomy X (r).26-34 kromě toho existuje jasné překrytí mezi vrozenými srdečními vadami převládajícími u mužských pacientů s KS (koarktace aorty a další levostranné překážky)a těmi, které se vyskytují u pacientů s chromozomy monosomie X a r (X).28,35 malých chromozomů r(X) obvykle vede k Turnerovu syndromu úplnou inaktivací r (X). Není však jasné, proč někteří jedinci vyvíjejí fenotyp podobný KS. Neúplná inaktivace chromozomu X a následná exprese obvykle potlačených genů byla navržena jako vysvětlení fenotypu KS u některých pacientů s r (X).32-34 KDM6A byl odstraněn u tří pacientů, kteří měli jak fenotyp podobný KS, tak r (X), ve kterém byly mapovány zarážky; toto zjištění je v souladu s hypotézou, že delece KDM6A hraje důležitou roli v fenotypu podobném KS pozorovaném u některých pacientů s r(X).30,32,34 nebyli jsme schopni prokázat haploinsuficienci pro KDM6A u pacientů 1 a 2, protože exprese KDM6A byla velmi nízká v lymfocytech periferní krve (údaje nejsou zobrazeny). Nicméně studie ukázaly, že dvě kopie Kdm6a jsou nezbytné pro normální expresi u samic myších embryí a dospělých myší,25 naznačuje, že haploinsuficience může být patogenním mechanismem. Toto vysvětlení by však nezohlednilo skutečnost, že 45, X a další pacienti s delecí KDM6A nevyvíjejí fenotyp Kabuki.

u pacientů 1 a 2 jsou poměry inaktivace molekulárních X silně zkreslené a jsou 89: 11 a 97:3. Inaktivační profil X byl stanoven pomocí PCR amplifikace CAG repetice v exonu 1 genu pro androgenní receptor před a po štěpení DNA HpaII a CfoI. Abychom zjistili, zda byla odstraněná kopie KDM6A umístěna na aktivním nebo neaktivním chromozomu X, provedli jsme fluorescenční in situ hybridizační (FISH) analýzu sondou KDM6A na chromozomech X, které byly odlišně označeny začleněním 5-brom-2 ‚ – deoxyuridinu (5-BrdU). Výsledky ukázaly, že odstraněná kopie KDM6A byla umístěna na neaktivním chromozomu X ve všech 70 mitózách analyzovaných u obou pacientů (obrázek 4). Skutečnost, že KDM6A uniká X-inaktivaci17 naznačuje, že lymfocyty stimulované fytohemaglutininem (PHA), které mají odstraněnou kopii KDM6A na neaktivním chromozomu X, mají výhodu v přežití oproti buněčným liniím, které mají odstraněnou kopii KDM6A na aktivním chromozomu X. Tento návrh je v souladu s hypotézou, že ačkoli KDM6A uniká inaktivaci X, jeho exprese je nižší z neaktivního chromozomu X než z aktivního chromozomu X.25

obrázek studie ryb na chromozomech X odlišně značených 5-BrdU

obrázek studie ryb ukazuje chromozomy X odlišně označené začleněním 5-BrdU. Neaktivní chromozom X (v bílém kruhu)se jeví jasnější než aktivní chromozom X. Subtelomerní sondy xqter hybridizují na oba chromozomy X (modré šipky). Signál KDM6A (bílá šipka) chybí v neaktivním chromozomu X a je přítomen na aktivním chromozomu X. Pro tento experiment byly lymfocyty periferní krve od pacientů 1 a 2 stimulovány fytohemaglutininem a byly kultivovány po dobu 72 hodin. abychom identifikovali pozdní replikaci neaktivního chromozomu X, ošetřili jsme buňky 5-BrdU (30 µg/ml) 5 hodin před sklizní. Kolcemid byl poté přidán do koncentrace 0, 2 µg / ml a o 1 hodinu později byly metafázové přípravky vyráběny standardními postupy zahrnujícími bobtnání v 75 mM KCl a fixaci v 3:1 methanol / kyselina octová. Provedli jsme analýzu ryb současným použitím subtelomerní sondy Xqter označené SpectrumOrange (Vysis) pro indikaci chromozomů X (modrá šipka) a RP11-435K1 značených SpectrumOrange (AmpliTech) pro rozlišení mezi odstraněnými a nedeletovanými chromozomy X (bílá šipka). Pro usnadnění detekce začleněného 5-BrdU jsme denaturovali buněčnou DNA v 2n HCl po dobu 30 minut při 37°C. 5-BrdU byl poté označen monoklonální protilátkou specifickou pro 5-BrdU konjugovanou na fluorescein (Roche) (1 µg/ml). Nakonec jsme protistanovili DNA aplikací antifadního roztoku obsahujícího 0.1 µg / ml DAPI.

úloha UTY je do značné míry neznámá a nemá in vitro demethylázovou aktivitu. Nález mužského KS jedince (pacient 3) s intragenní delecí KDM6A as klinickou závažností podobnou závažnosti pacienta 1 naznačuje, že UTY by mohla částečně kompenzovat ztrátu KDM6A u mužských jedinců, jak bylo dříve naznačeno v literatuře.25

pokud jde o MLL2, somatické homozygotní a hemizygotní mutace v KDM6A byly identifikovány u různých typů rakoviny (mnohočetný myelom, spinocelulární karcinom jícnu, karcinom ledvinových buněk, myeloidní leukémie, rakovina prsu, kolorektální karcinom a glioblastom), což naznačuje, že KDM6A je gen potlačující nádor.14 nicméně rakovina není klíčovým rysem KS, vzhledem k tomu, že tato komplikace byla hlášena pouze u sedmi pacientů s KS36,37 (akutní lymfoblastická leukémie, Burkittův lymfom, fibromyxoidní sarkom, synoviální sarkom a hepatoblastom byly hlášeny jednou a neuroblastom byl hlášen u dvou jedinců KS).35,36 pokud je ztráta obou alel dostačující k vyvolání rakoviny, dalo by se očekávat, že se rakovina vyskytne častěji u KS, například u retinoblastomu (MIM 180200) nebo Wilmsova nádoru (MIM 194070). To naznačuje, že ztráta druhé alely u MLL2, KDM6A nebo UTY je nezbytná, ale není dostatečná pro vývoj rakoviny, nebo že tato komplikace je nedostatečně rozpoznána, což dokazuje význam přírodovědných studií u vzácných syndromů.37

následující histonové metylázy a histonové demetylázy byly zapojeny do dalších syndromů s více anomáliemi: EHMT1 (MIM 607001; Kleefstra syndrom), SETBP1 (MIM 611060; Schinzel-Giedionův syndrom), JARID1C (MIM 314690; Claes-Jensenův typ, X-spojený syndrom mentální retardace), PHF8 (MIM 300560; Syndrom mentální retardace spojený s X) a MLL2 v KS. Identifikace patogenních mutací KDM6A u pacientů s KS rozšiřuje roli faktorů modifikujících Histon v mentálním postižení a vrozené malformaci.

závěrem uvádíme mutace KDM6A jako příčinu KS u jednoho muže a dvou žen. Naše zjištění potvrzují jak KS genetickou heterogenitu, tak lokus na chromozomu X, jak bylo navrženo dříve. Protože někteří pacienti s KS byli negativní na sekvenování MLL2, KDM6A a UTY a během screeningu nevykazovali delece nebo duplikace, je pravděpodobné, že další geny spojené s KS zůstanou objeveny.