Rozhovor s Johnem Gurdonem / rozvoj

váš první příspěvek byl publikován v roce 1954 a netýkal se embryologie, ale entomologie. Jak k tomu došlo?

no, tento časný článek byl publikován v Entomologově měsíčníku. Během mého raného života jsem se opravdu zajímal o hmyz a sbíral motýly a můry. Když jsem byl vysokoškolák, rád jsem si vzal volno a šel do Wytham Woods poblíž Oxfordu, abych zjistil, co najdu. Tak jsem šel ven jednoho studeného jarního dne a nebyly tam žádné motýly, ani žádné můry, ale, z ničeho nic, tam byla moucha-chytil jsem to, dal to do mé láhve, a podíval se na to. První věc, která byla zřejmá, bylo, že to nebyla moucha, byl to hymenopteran, ale když jsem se to pokusil identifikovat, prostě jsem nemohl přijít na to, co to bylo. Nemám rád porážku, tak jsem šel do oddělení naděje v Oxfordu a oni nevěděli, co to je, a pak do Přírodovědného muzea, kde mi kurátor řekl, že kupodivu to byl druh, který nikdy předtím nebyl zaznamenán v Anglii! To bylo intenzivně dráždivé pro Entomologické oddělení v Oxfordu, protože profesor v té době měl velkou ekologickou studii o všem hmyzu v těchto lesích, a tady byl student, který právě chytil první věc, kterou mohl najít, a zvedl nový druh. Tak jsem napsal pár odstavců oznamujících objev, a tak jsem přišel k tomu papíru.

a udržovali jste svůj zájem o hmyz?

ne ve skutečnosti řádným vědeckým způsobem, i když si stále myslím, že bych se k tomu rád vrátil, hlavně proto, že barevné vzory lepidopteranů jsou tak pozoruhodné. Opravdu nevíme téměř nic o tom, jak se vytvářejí barevné vzory-u jakéhokoli druhu. Nebudete mít gen, který by umístil místo na jedno křídlo, je to složitější proces, včetně difúze molekul. Pořád si myslím, že až skutečně odejdu do důchodu, vezmu to nahoru, ale ještě jsem se k tomu nedostal!

před půl stoletím jste zahájili své experimenty s jaderným přenosem a dnes o tom vaše laboratoř stále publikuje. Proč si myslíte, že takový koncepčně jednoduchý experiment měl tak pozoruhodně dlouhou trvanlivost?

když jsem dělal ty rané experimenty s jaderným přenosem – a jsem trvale vděčný svému nadřízenému Michaelu Fischbergovi za to, že mě do této práce vložil – otázka v té době byla, zda všechny buňky v těle mají stejné geny. Jedním ze způsobů, jak to zjistit, bylo vzít jádro z jednoho druhu buňky, dát ho do vajíčka a zjistit, zda se může vyvinout. Tento experiment byl koncipován již na konci 19. století: existuje článek muže jménem Rauber, který popisuje experiment vložení jádra ropuchy do žabího vejce, a jednoduše říká, že nedostal výsledek, takže není jasné, zda experiment provedl nebo ne!

Každopádně v padesátých letech Briggs a King, dva Američané, vyvinuli techniku transplantace jádra a Fischberg se rozhodl, že bychom to měli zkusit v Xenopusu. Bylo několik velmi obtížných technických obtíží, které jsme nakonec překonali-stejně jako štěstí jako dovednost – a konečným výsledkem bylo, že můžete dosáhnout v podstatě normálního vývoje tím, že vezmete jádro specializované buňky, v tomto případě střevní buňky, a transplantujete ji do enukleovaného vajíčka. To jasně říká, že stejné geny jsou přítomny ve všech různých druzích buněk.

a pak byla tato mezera 50 let předtím, než Yamanaka vyvinul indukovanou techniku pluripotentních kmenových buněk, která skutečně otevřela pole užitečnému klinickému potenciálu. Žabí experimenty (a mnoho následných prací, včetně generace ovcí Dolly v 1990ech) říkaly, že můžete zvrátit nebo omladit specializované jádro hned na začátek, ale klinický překlad se stal realistickou možností u lidí pouze tehdy, když Yamanaka ukázal, že nepotřebujete získat lidská vejce nebo embrya, abyste vytvořili kmenové buňky. Tato myšlenka, že byste mohli odvodit nové buňky jednoho druhu počínaje dospělými buňkami zcela jiného druhu, samozřejmě zazvonila naší prací z půl století předem, ale, zajímavé, to nebylo absolutně zřejmé, když byly tyto rané experimenty provedeny. ‚Přeprogramování‘ nebylo ani cílem experimentů. Představuji si, že bych dnes nezískal podporu pro provádění těchto experimentů s jaderným přenosem, kdyby to nebylo pro jejich význam pro přeprogramování u lidí.

Otázkou tedy je, jak tento proces funguje? Co je základem schopnosti vajíčka omlazovat jádro? O tuto otázku jsme se vždy zajímali, ale s Yamanakovými experimenty to bylo stále zajímavější. A chtěl bych zdůraznit, že lidé stále nevědí, proč postup Yamanaka funguje – ani po deseti letech tomu mechanismu opravdu nerozumí. Takže vezmeme názor, a je pravda, že vejce odvádí lepší práci při zvrácení diferenciace ve srovnání s nadměrně expresivními transkripčními faktory, a proto si myslíme, že kdybyste věděli, co jsou všechny složky vajec, a věděli, jak je vyměnit za somatické, nepotřebovali byste yamanakové faktory. Proto aktivně sledujeme mechanismus přeprogramování vajíčkem pomocí stejného postupu, jaký byl proveden před 60 lety, ale s mnoha novými způsoby jeho vyšetřování. Pro mě je to příklad zajímavého principu, že práce, která byla provedena najednou, může mít následný, mnohem větší význam ve světle pozdějších pokroků.

aktivně sledujeme mechanismus přeprogramování vajíčkem pomocí stejného postupu, jaký byl proveden před 60 lety, ale s celou řadou nových způsobů jeho zkoumání

a jaké je vaše současné chápání molekulárních mechanismů přeprogramování vajíčkem?

je to téměř jistě kvůli vysoké koncentraci chromatinových složek ve vajíčku, zejména histonů. Existuje mnoho variant histonů, pokud jde o to, jak jsou modifikovány, a docela hodně z naší nedávné práce popisuje změny histonů, které vejce ukládá na příchozí jádro. Tato změna chromatinu je možná první klíčovou fází – ve vejcích je přítomna určitá histonová varianta, která je velmi důležitá, a je pravděpodobné, že nahrazení složek dospělého chromatinu složkami přítomnými ve vejci je nakonec to, co pomáhá způsobit změnu.

tento problém má dva aspekty. Jedním z nich je, jak vejce používá své složky k nahrazení složek somatického jádra,a tak ho omlazuje? Druhým důvodem je, proč přeprogramování nefunguje dokonale? Rád to ilustruji takto: probíhá bitva mezi vajíčkem, které se snaží vše vrátit do embryonálního stavu, a somatickým jádrem, které je navrženo tak, aby bylo přesně opačné – má se neměnit. Většina našich buněk se nemění a je velmi důležité, aby byly buňky mimořádně stabilní. Takže vejce se snaží ovládnout jádro, a jádro se snaží odolat; to jsou dvě vzájemně se doplňující části našeho výzkumného projektu.

abychom to doplnili, díváme se také na změny, ke kterým dochází u jádra spermií, díky nimž je tak pozoruhodně vnímavé k přeprogramování; nakonec bychom chtěli převést somatické jádro do stejného stavu jako spermie, a přeprogramování by mělo fungovat velmi dobře.

i když si myslím, že většina čtenářů bude obeznámena s vašimi přeprogramovacími experimenty, rád bych probral některé z vašich dalších prací. V sérii článků v 70. letech jste studoval překlad injikované RNA do žabích oocytů: můžete nám něco říct o této práci?

experiment, který mě v té době nesmírně oslovil a stále dělá, je injektovat messengerovou RNA (mRNA) do vajec. Dělal jsem tuto práci, když lidé, zejména Hubert Chantrenne v Belgii, poprvé izolovali mRNA. Byl jsem dobrým přítelem úžasného muže jménem Jean Brachet a řekl jsem mu, že to, co bych opravdu rád udělal, je transplantovat ne jádra, ale mRNA do vajec. Dal mi úvod do Chantrenne, který dělal králičí globin RNA a dal nám některé, díky Brachet. Bylo známo, že věci jsou extrémně citlivé na Rnázu, takže jste se téměř museli vykoupat v kyselině chromové, než jste se něčeho dotkli! Kdybych navrhl tento experiment jako grant, byl by odmítnut, protože bylo známo, že vejce je plné ribonukleáz: dát citlivou mRNA do ribonukleového prostředí by nemělo smysl. Přesto to fungovalo a kupodivu dobře-globinová zpráva přešla do vajec a v době, kdy se vejce změnila na pulce, se ještě vyráběl králičí globin. Téměř jistě důvodem úspěchu je, že mikroinjekce neotevře lysosomy, kde jsou ribonukleázy rozděleny. Existuje tedy další zajímavý princip: když vám někdo řekne, že něco nefunguje, je mnohem lepší to zkusit, než si za to vzít slovo. A injekce mRNA se ukázala jako velmi užitečný přístup pro všechny druhy otázek. Tyto experimenty s RNA byly skutečně derivátem technologických výsledků jaderného přenosu – pokud to funguje pro jádra, co jiného můžete přenést? Eddy De Robertis a já jsme dokonce měli papír, který nazval vejce Xenopus živou zkumavkou.

zajímal jste se také o proces indukce a identifikoval jste „komunitní efekt“ při indukci mezodermu Xenopus. Jaký je základ tohoto účinku?

po mnoho desetiletí lidé transplantovali tkáň-vzali kus tkáně a naroubovali ji na jiného hostitele. Ale tkáň je samozřejmě složena z mnoha buněk, které nemusí být všechny stejné, a pro mě bylo vždy žádoucí provést jednobuněčnou transplantaci. A tak jsem jich udělal spoustu, přesunul jednotlivé progenitorové buňky z jedné části embrya do druhé, ale nikdy jsem to nemohl dostat do práce-buňky vždy odumřely. Musí existovat nějaký důvod, proč můžete úspěšně transplantovat více buněk, ale ne jednotlivé buňky. To mě vedlo k provádění injekcí menšího a menšího počtu buněk. Ukázalo se, že transplantované buňky uvolňují sekretované molekuly – například signalizační proteiny – které jsou nezbytné pro to, aby v hostiteli mohly dělat cokoli. Jedna buňka má potíže s tím, co vylučuje-koncentrace je příliš nízká – ale více buněk vytvoří dostatečně vysokou koncentraci, aby skutečně fungovala. Tento „komunitní efekt“ je poněkud analogický s vnímáním kvora identifikovaným u bakterií.

jaký je váš pohled na to, kde je vývojová biologie jako obor dnes? Jaké jsou mezery v našem chápání a co musíme udělat, abychom zaplnili mezery?

můj vlastní pohled na vývoj je, že člověk se musí snažit zúžit věci na jednotlivé entity, ať už je to buňka nebo jádro nebo molekula, a často jsem zesměšňován, protože se vždy ptám lidí, v jaké koncentraci je jejich molekula, a řeknou, že na tom nezáleží.

řekl bych, že koncentrace a čas jsou dvě zásadní věci ve vývoji. Musíte znát koncentraci a musíte vědět, jak dlouho tam musí být, abyste mohli něco změnit – protože pro buňky nemusí být konkrétní koncentrace molekuly na několik sekund stejná jako tato koncentrace po dobu 10 minut. Takže bych se domníval, že to, co nám ve vývojové biologii v současné době chybí, je jakákoli schopnost určit koncentraci proteinů, analogická měření nukleových kyselin pomocí PCR.

z vlastní zkušenosti jsem se zapojil do experimentů na proteinu zvaném aktivin, molekule TGF-β. Docela úžasně – a stále se mi líbí tento experiment – můžete vzít blastulové buňky, úplně je disociovat v suspenzi a poté přidat aktivin ve známé koncentraci po známou dobu. Pak buňky umyjete a necháte je reagovat a zeptáte se, jak se odlišují. Ukázalo se, že výsledek-ať už tyto buňky vytvořily ektoderm, mezoderm nebo endoderm-závisel nejen na množství aktivinu, ale také na době, kdy jste buňky v něm koupali. Byl to zajímavý princip, že koncentrace a čas mohou mít zcela odlišné účinky v závislosti na tom, který z nich změníte a o kolik.

ale abychom skutečně pochopili úžasné jevy, jako je tento in vivo, znalost koncentrace proteinů bude opravdu důležitá, a myslím, že nám to v tuto chvíli zcela chybí. V budoucnu budeme postupně pracovat s jednotlivými buňkami, známými koncentracemi, známým množstvím času, a pak můžeme pochopit, co se děje v těchto diferenciačních událostech.

koncentrace a čas jsou dvě kritické věci ve vývoji

vaše práce bude pravděpodobně nejvíce klinicky vlivná v oblasti náhrady buněk-co si myslíte o současných výzvách a vyhlídkách?

myslím, že vyhlídky na náhradu buněk jsou velmi dobré, ale vědecký pokrok by mohl být bráněn jinými věcmi. Příklad, který často používám, je věkem podmíněná makulární degenerace, kde fotoreceptory umírají, a tak oslepnete. Tyto fotoreceptory jsou podporovány pigmentovanými epiteliálními buňkami sítnice a vědci v Londýně a jinde mohou použít postup Yamanaka k vytvoření tenkých vrstev epiteliálních buněk a poté je vložit do oka procesem, který není složitější než výměna čočky. Kdykoli o tom mluvím, lidé za mnou přicházejí a ptají se, kdy to zvládnou. Odpověď zní, že jim to není dovoleno, a důvod se podle mého názoru nakonec vrací k právním otázkám. Pokud se něco pokazí, právníci budou bojovat o obrovské částky odškodnění. Když uděláte zákrok stokrát a jednou se to pokazí-devadesát devět lidí ohromně získá tím, že neoslepne, ale člověk dostane tak masivní finanční odměnu, že se mu lékařská profese bude vyhýbat. Myslím, že je to skutečná výzva pro tento obor-odolnost lékařské profese kvůli možným právním a finančním důsledkům.

dříve jste hovořili o důležitosti vedení, které váš vedoucí PhD Michael Fischberg a mnoho vašich mentees hovořilo o vás jako o skvělém mentorovi. Jaký je Gurdon styl vedení?

no, Byl bych zde velmi sebekritický – nesedím si s každým hodinu týdně, abych si prošel jejich výsledky, jen čekám, až je uvidím u kávy a zeptám se, jak se věci vyvíjejí. Takže musím být strašně špatný mentor ve smyslu, že opravdu nedělám pravidelnou a metodickou kontrolu věcí. Ale rád si myslím, že lidé získají něco jen z běžné konverzace. Někdo jako Doug Melton byl opravdu fantastický kolega, ale to bylo všechno díky jeho vlastním schopnostem – nemůžu si myslet, co ode mě dostal! Jednoduše se snažím přesvědčit lidi, kteří přicházejí do mé laboratoře, aby pracovali na hodnotném projektu, a pak je nechte, aby si to užili.

měl bych jen podotknout, že Michael Fischberg byl opravdu pozoruhodný a velkorysý rádce. Dal mě na tuto jadernou přenosovou práci, řekl mi, že bych měl zkusit cokoli, co chci, a byl velmi podporující. Úplně první článek o jaderném přenosu-neudělal experimenty – ale byl na něm autorem,a zcela správně. Ale poté, téměř k mému rozpakům, řekl :“ Ty si vezmeš endodermální buňky, já si vezmu zbytek“. A tak nebyl autorem dalších dokumentů – bylo to pozoruhodně velkorysé, opravdu.

chtěl jsem se zeptat, jestli jste stále připojeni k laboratorní lavici, ale dostal jsem odpověď, když jsem dnes dorazil do vaší kanceláře, když jste měnili média za dávku vajec Xenopus. Je pro vás důležité udržovat toto spojení?

vždy jsem udržoval svou laboratorní práci, i když jsem dělal i jiné věci, a stále učím své kolegy. Toto spojení s lavičkou samozřejmě není realistické pro každého, ale rád si myslím, že tím někdy objevíte věci, které nemusí být zřejmé. Nemá smysl, abych používal PCR stroje nebo takové věci, a jeden z mých kolegů v tuto chvíli pro mě provozuje western blot. Ale laboratorní práce, kterou teď dělám, je více závislá na snaze najít způsoby, jak přimět tyto buňky, aby dělaly to, co chci, aby dělaly – a to je něco, co dobře vím.

změnila Nobelova cena váš život znatelně?

no ano, v tom smyslu, že dostávám absurdní množství pozvánek, které nyní běží asi 200 ročně. Nemůžete to začít zvládat – cestuji méně než dříve, a jsem spíše selektivní ohledně toho, co přijímám. Dostávám spoustu pozvánek ne za svůj vědecký příspěvek, ale spíše za svou školní zprávu, ve které můj mistr biologie napsal, že bych neměl šanci uspět jako vědec, a který je orámován nad mým stolem. Tento příběh samozřejmě také udělal velký dojem.

je tu také uznání veřejnosti. Velmi brzy po udělení Nobelovy ceny jsem byl náhodou v Jižní Koreji. Když jsem šel po ulici, někdo mě zastavil a zeptal se, jestli jsem doktor Gurdon, a řekl mi, že moje fotografie je v novinách. Bylo to opravdu pozoruhodné, pokrytí, které cena získala. Je také samozřejmě hezké, že lidé oceňují mou práci, a Yamanaka, a že lidé mluvili o přeprogramování.

je něco, co by čtenáři vývoje byli překvapeni, kdyby se o vás dozvěděli?

zastávám názor, že je důležité udržovat přiměřeně fit a zdravé. Vždy jsem se zajímal o různé sportovní aktivity, zejména lyžování, bruslení a squash, což byly moje hlavní aktivity, i když jsem se v posledních letech obrátil na tenis ze squashe.

ale předpokládám, že to, co by mohlo čtenáře překvapit, je, že jsem úplný neintelektuál. Knihy prostě nečtu, čtení nesnáším a do divadla taky nechodím. Pokud se mě zeptám, proč se mi čtení nelíbí, řeknu, že to trvá dlouho, je mnohem snazší mluvit s někým, kdo knihu četl, a požádat o spodní řádek! Fikce mě nezajímá, prostě to není pro mě. Takže jsem opravdu konečný neintelektuál.