Kinázový test
připravený Swathi Arur
Protein kináza (zásobní roztoky 1-10 mg / ml čistých kináz) – pro tyto testy používám purifikovanou erk2 kinázu (NEB) – Pro každý enzym je důležité stanovit optimální pufr, iontovou sílu a pH pro aktivitu. Pokud tyto podmínky nebyly stanoveny, lze jako výchozí bod použít níže uvedený protokol.
substrát (zásobní roztok 10 mM) – substráty obvykle obsahují jeden serin / threonin v motivu místa fosforylace. Jako kontrolu používám myelinový bazický Protein (získaný ze Sigma), který byl použit NEB ke kalibraci erk2 kinázy.
kromě toho by substráty měly mít čistý kladný náboj, aby se usnadnila vazba na fosfocelulózové filtry použité v testu. Pro kvantitativní vazbu na fosfocelulózový papír se doporučuje mít alespoň 2 bazická rezidua a volný amino konec. Není-li motiv fosforylačního místa znám, lze použít obecný substrát tyrosinkinázy. Například“ myelinový základní Protein “ (je nespecifickým substrátem pro mnoho MAPK). Pro počáteční reakce by měla být použita koncentrace substrátu 0,7-1,5 mM. Pro stanovení kinetických parametrů pro fosforylaci syntetického peptidu je vyžadován rozsah koncentrací peptidů
10X Kinázový pufr-obsahuje 5 mg / mL BSA – aby se zabránilo adsorpci kinázy do testovací zkumavky), 150 mM Tris-Cl (pH 7,5).
ATP / MgCl2 (zakoupeno od Upstate Biotech-Magnesium / ATP Cocktail # 20-113) – je vhodný zásobní roztok 1-5 mM. Všimněte si, že většina MAPK má hodnoty Km pro ATP v rozmezí 10-150 uM, takže pro kinetické experimenty je důležité použít saturační koncentrace ATP k dosažení hodnot Km a Vmax pro peptidy.
ATP-10 mCi / ml.
ERK2 kinázové testy
a) AUTORADIOGRAFICKÝ test:
- standardní kinázový test se provádí v objemu 25 ul:
- 2,5 ul 10x kinázového pufru
- 5 ul 1,0 mM MgCl2 /ATP (0,2 mm konečná koncentrace)
- ATP (100-500 cpm/pmol)
- 3 ul 10 mM substrátu (1 .2 mM konečná koncentrace)
- 1 U ERK2 kinázy
- H2O až 25 ul
1. Před experimenty připravte koktejl obsahující dostatek pufru, ATP a ATP k dokončení testů. Pro testy při různých koncentracích substrátu by měl být substrát zředěn a přidán Samostatně do každé zkumavky. Po dávkování koktejlu do 1,5 ml mikrocentrifuge zkumavek umístěte zkumavky do vodní lázně při 30 stupních C po dobu 30 minut. Reakce by měly být zahájeny přidáním kinázy a měly by pokračovat při 30 stupních C.
2. Po požadované době ukončete reakce přidáním 2 X SDS vzorkového pufru a vyčerpejte gel.
3. Vysušte gel na papíře Whatman 3.0 a vystavte suchý gel autoradiogramu a udržujte kazetu na-70cpo dobu 2 hodin. (při delších expozicích se ujistěte, že je film znovu suchý, než na něj nasadíte nový autoradiogram).
b) kinetická analýza:
1. Proveďte kinázový test, jak je uvedeno výše, tentokrát použijte různé koncentrace substrátů od 50nM do 1 mm. Zastavte reakci po 30 minutách přidáním 45 ul ledové 10% kyseliny trichloroctové (TCA) ke každé reakci. Vortex reakce.
3. Odstřeďujte 2 minuty v mikrocentrifuge (10K ot / min).
4. Bod 35 ul supernatantů na kruhy filtru Whatman P81 s celulózovým fosfátem o průměru 2,1 cm.
6. Kruhy filtru P81 třikrát omyjte 500 ml studené 0, 5% kyseliny fosforečné (5-10 minut na praní). Po postupu pracích kroků může následovat odstranění filtračního kruhu P81 pro prázdnou reakci a kontrola pomocí Geigerova čítače.
7. Jednou promyjte 200 ml acetonu při pokojové teplotě po dobu 5 minut.
8. Nechte kruhy filtru zaschnout při pokojové teplotě.
9. Vložte filtrační kruhy do scintilačních lahviček a změřte začlenění 32P počítáním destiček suchých v scintilačním počítadle. Specifická aktivita ATP v kinázové reakci (např. v cpm / pmol) může být stanovena nanesením malého vzorku (2-5 ul) reakce na filtrační kruh P81 a přímým počítáním (bez promývání). Počty za minutu získané při kinázové reakci (minus blank) se pak dělí specifickou aktivitou pro stanovení molů fosfátu přenášeného v reakci.
kinetika fosforylace substrátu
kinetické parametry fosforylace substrátu pomocí MAPK lze stanovit pomocí variace na výše uvedeném protokolu.
1. Proveďte reakci při vysoké koncentraci substrátu, abyste zjistili, že protein je substrát.
2. Změňte koncentraci enzymu v testu. Rychlost fosforylace substrátu by měla být úměrná koncentraci enzymu za podmínek testu. Tento experiment se také používá ke stanovení množství enzymu potřebného pro kinetické studie.
pro stanovení rychlosti by měl být proveden časový průběh fosforylace substrátu. V tomto případě připravte větší enzymovou reakci (použijeme 150 ul). V požadovaných časových bodech odeberte 25 ul alikvotů a přeneste je do mikrocentrifugačních zkumavek obsahujících 45 ul ledově studeného 10% TCA a analyzujte reakce, jak je popsáno výše. Fosforylace substrátu by měla být lineární s časem a pro měření kinetických konstant by měly být použity počáteční rychlosti reakce (5%).
3. Změňte koncentraci substrátu v testu. Použijte graf rychlosti vs. koncentrace peptidu získat počáteční odhad hodnoty Km. Při tomto počátečním měření by měl být použit široký rozsah koncentrací substrátu (např. 20 uM až 2 mM).
4. Pro stanovení Km (substrát) a Vmax měňte koncentraci substrátu a změřte rychlost přenosu fosfátů. Dobrý rozsah koncentrací substrátu jsou následující násobky Km: 0,125 X Km, 0,25 x Km, 0,5 x Km, 1,0 x Km, 2,0 x Km, 4,0 x Km, 8,0 x Km. Reakce by měly být prováděny ve trojím vyhotovení pro dosažení nejlepších výsledků.
5. Kinetické konstanty jsou určeny váženými nelineárními nejmenšími čtverci, které odpovídají hyperbolické rychlosti vs. grafy pomocí iterativních programů, jako je NFIT (Island Products, Galveston, TX).
výpočet RAR:
RAR: relativní Akceptorový poměr = Vmax / Km definovaný jako celkové měřítko schopnosti proteinu fungovat jako substrát.
normalizuji RAR daného substrátu bazickým proteinem myelinu, tj. vypočítám hodnotu RAR pro každý substrát a poté ji vydělím hodnotou RAR bazického proteinu myelinu (čímž nastavím MBP na 1,0).
