- Abstrakt
- 1. Úvod
- 2. Materiály a činidla
- 2.1. Izolace a kultivace lidských limbálních epiteliálních buněk
- 2.2. Test účinnosti formování kolonií (CFE)
- 2.3. Test zdvojnásobení buněčné populace
- 2.4. Extrakce RNA a kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase
- 2.5. Imunofluorescenční barvení
- 2.6. Western Blot analýza
- 2.7. Statistika
- 3. Výsledky
- 3.1. Fenotyp epiteliálních kmenových buněk rohovky v médiu Sr
- 3.2. CFE test
- 3.3. PCR a analýza PCR v reálném čase
- 3.4. Imunofluorescenční barvení
- 3.5. Western Blot
- 4. Diskuse
- konkurenční zájmy
- poděkování
Abstrakt
limbální epiteliální buňky mohou být udržovány na krmné vrstvě 3T3 s kultivačním médiem doplněným o fetální bovinní sérum a tyto buňky byly použity k úspěšné léčbě deficitu limbálních kmenových buněk. Fetální bovinní sérum však obsahuje neznámé složky a vykazuje kvantitativní a kvalitativní variace šarže od šarže. Pro zlepšení stavu kultury byla zkoumána definovaná náhrada Knockoutového séra za účelem nahrazení fetálního hovězího séra pro kultivaci lidské limbální epiteliální buňky. Lidské primární limbální epiteliální buňky byly kultivovány v Knockoutovém séru a fetálním bovinním séru doplněném médiem. Rychlost růstu buněk, genová exprese a udržování limbálních epiteliálních kmenových buněk byly studovány a porovnávány mezi těmito dvěma skupinami. Lidské primární limbální epiteliální buňky byly izolovány a úspěšně sériově kultivovány v tomto novém médiu doplněném Knockoutovým sérem; proliferace buněk a udržování kmenových buněk byly podobné buňkám pěstovaným v médiu doplněném fetálním bovinním sérem. Tato data naznačují, že toto KnockOut sérum doplněné médiem je účinnou náhradou tradičního fetálního hovězího séra doplněného médiem pro limbální epiteliální buněčnou kulturu a toto médium má velký potenciál pro dlouhodobé udržování limbálních epiteliálních buněk, transplantace limbálních epiteliálních kmenových buněk, a regenerace tkání.
1. Úvod
rohovkové epiteliální kmenové buňky jsou umístěny v bazální vrstvě limbu, vlnité a pigmentované struktuře zvané palisády Vogta . Tyto kmenové buňky udržují nepřetržitou obnovu epitelu rohovky po celý život a nahrazují poškozené nebo ztracené epiteliální buňky rohovky . Deficit limbálních kmenových buněk (LSCD) a související oční povrchová onemocnění lze úspěšně léčit pomocí kultivovaného limbálního epiteliálního autograftu . Úspěch těchto chirurgických zákroků závisí na účinné expanzi limbálních epiteliálních kmenových buněk, které ve většině případů zahrnovaly krmnou vrstvu 3T3 a fetální hovězí sérum (FBS). 3T3 feeder vrstva kultivační systém byl zřízen Rheinwald a Green a byl úspěšně použit k expanzi epiteliálních buněk z lidské kůže, vlasový folikul, limbus, spojivky a ústní sliznice tkáně . FBS však není dobře definován a vždy zobrazuje kvantitativní a kvalitativní variace šarže od šarže . FBS také obsahuje potenciálně škodlivé xenogenní složky, které mohou stimulovat imunologické reakce a přenášet choroby zvířat a patogeny . Se všemi těmito obavami roste potřeba vyvinout dobře definované kultivační médium, které nahradí tradiční FBS doplněné médium.
v současné době existují určitá alternativní média bez séra pro růst epiteliálních buněk, jako je definované médium bez séra keratinocytů (KSFM™, Invitrogen, USA), médium pro růst keratinocytů (KGM™, Clontech, USA), Epilife™ (Invitrogen, USA) a média cílená na progenitorové buňky (pct) (CellnTEC™, Švýcarsko). Ukázalo se, že tyto produkty podporují expanzi epiteliálních buněk rohovky. Stále však potřebují doplňky nedefinovaných produktů, jako je extrakt z hypofýzy skotu (BPE) nebo lidský sérový albumin (HAS). A většina z těchto médií vyžaduje vysokou hustotu očkování buněk, což nemusí být praktické pro expanzi epiteliálních buněk lidské rohovky. Navíc rohovkové epitelové kmenové buňky, které jsou detekovány jako holoklony v kultivačním systému 3T3, nemohly být dlouhodobě udržovány v tomto kultivačním médiu bez séra . K dnešnímu dni neexistuje žádné definované médium bez séra, které by mohlo dlouhodobě podporovat expanzi epiteliálních kmenových buněk rohovky.
KnockOut serum replacement (SR) je definovaná formulace bez séra, která byla navržena tak, aby přímo nahradila FBS pro udržování embryonálních kmenových buněk (Esc) a indukovaných pluripotentních kmenových buněk (IPSC). Bylo prokázáno, že KnockOut SR poskytuje konzistentní růstové podmínky pro es buňku a iPSC kulturu a Es buňky pěstované v KnockOut SR doplněné médium jsou podstatně méně diferencované než buňky pěstované v FBS doplněném médiu a přenos zárodečných linií není přinejmenším ohrožen. Vzhledem k podobnostem v kultivačních metodách epiteliálních buněk a Es buněk, a s ohledem na skutečnost, že KnockOut SR nahrazuje FBS v buněčné kultuře ES, zde se předpokládá, že KnockOut SR by mohl být použit k nahrazení FBS v kultuře limbálních epiteliálních buněk.
2. Materiály a činidla
buněčné kultivační misky, baňky, centrifugační zkumavky a sérologické pipety byly zakoupeny od společnosti Becton Dickinson(Franklin Lakes, NJ; http://www.bd.com/). Dulbecco ‚s Modified Eagle‘ S Medium (DMEM), Ham ‚ s F-12, HEPES, penicilin a streptomycin, L-glutamin, 0,05% trypsin-0.02% EDTA solution, Superscript III kit a rneasy™ kit byly získány od Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). Fetální bovinní sérum (FBS) bylo zakoupeno od společnosti Hyclone (Logan, UT; http://www.hyclone.com/). Myší NIH 3T3 fibroblasty (ATCC CCL 92) byly získány z amerického typu Culture Collection (Rockville, MD; http://www.atcc.org/). Dispase II pocházel z Roche. Monoklonální protilátka (mAb) proti ABCG2 (klon BXP-21) a connexinu 43 pocházely z Millipore; p63 (klon 4A4), K5 a K19 pocházely ze Santa Cruz; K3 mAb (klon AE5) pocházel z ICN Pharmaceuticals (Costa Mesa, CA; http://www.mpbio.com/). Alexa Fluor 568-konjugovaná kozí anti-myší sekundární protilátka byla z Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). GeneAmp RNA-PCR a Taqman Universal PCR Master Mix AmpErase ung soupravy byly z Applied Biosystems (Foster City, CA; http://www.appliedbiosystems.com/). Mitomycin C, hovězí inzulín, lidský transferrin, hydrokortizon, lidský epidermální růstový faktor (EGF), toxin cholery a další činidla pocházely ze Sigma-Aldrich (St. Louis; http://www.sigmaaldrich.com/).
2.1. Izolace a kultivace lidských limbálních epiteliálních buněk
rohovka-limbální kroužky byly sklizeny od pěti zdravých dárců těsně po transplantaci rohovky, byl požadován informovaný souhlas a protokol o odběru vzorků byl schválen institucionální revizní komisí (IRB) univerzity Jilin. Čerstvé rohovky-limbální kroužky byly ošetřeny 0,25% Dispázou II při 4°C přes noc a epiteliální vrstva byla vydrhnuta z podkladové stromové tkáně a ošetřena 0,05% trypsinem-0,02% EDTA při 37°C po dobu 15 minut. Aktivita trypsinu byla neutralizována 10% FBS a disociované limbální epiteliální buňky byly odebrány a centrifugovány při 1500 ot / min po dobu 5 minut. Životaschopnost epiteliálních buněk byla stanovena trypanovou modří s výjimkou barvení a počet buněk byl počítán pomocí hemocytometru.
myší fibroblasty 3T3 byly udržovány v médiu Dulbecco modifikovaného Orla (DMEM, vysoká glukóza) doplněném o 10% FBS, L-glutamin (2 mM) a penicilin-streptomycin (50 IU/mL) a kultivovány 5% CO2 a zvlhčenou atmosférou. 3T3 buňky byly subkultivovány každých 6 dní při dosažení 80-90% soutoku. Buňky 3T3 byly sériově udržovány a pouze buňky před průchodem 20 byly použity pro přípravu krmné vrstvy. Pro přípravu krmné vrstvy byly konfluentní buňky 3T3 ošetřeny mitomycinem C (10 µg / mL)po dobu 2 hodin při 37°C, dvakrát promyty PBS a ošetřeny 0,05% trypsinem po dobu 5 minut při 37°C. fibroblasty 3T3 byly poté odebrány a pokoveny při hustotě 30 000 buněk/cm2 jeden den před zasetím epiteliálních buněk.
lidské limbální epitelové buňky byly kultivovány na krmné vrstvě 3T3 za použití média FAD nebo média pro substituci séra (SR). Médium FAD je směs dmem a Hamova média F-12 (1 : 1) obsahující 10% fetálního hovězího séra, L-glutamin (2 mM) a penicilin-streptomycin (50 IU/mL), epidermální růstový faktor (10 ng/mL), inzulín (5 µg/mL), adenin (0, 18 mM), hydrokortison (0, 4 µg/mL), toxin cholery (0, 1 nM) a trijodtyronin (2 nM). SR médium je směs dmem a Ham F-12 média (1 : 1) obsahující 10% KnockOut SR substituce séra, L-glutamin (2 mM) a penicilin-streptomycin (50 IU / mL), epidermální růstový faktor (10 ng / mL), inzulín (5 µg / mL), adenin (0,18 mM), hydrokortison (0.4 µg/mL), toxin cholery (0, 1 nM), trijodtyronin (2 nM), transferrin (5 µg/mL) a selen (5 ng/mL). Limbální epitelové buňky byly naočkovány na krmnou vrstvu 3T3 o hustotě 6 000 buněk / cm2 a kultivovány 5% CO2 a zvlhčenou atmosférou. Médium FAD bylo měněno každé 3 dny, zatímco médium SR bylo měněno každé 2 dny.
2.2. Test účinnosti formování kolonií (CFE)
pro test CFE bylo 200 lidských limbálních epiteliálních buněk z kultury FAD nebo kultury SR naneseno na 100 mm Petriho misku obsahující mitomycin C-ošetřenou 3T3 krmnou vrstvu a kultivováno, jak je popsáno výše. Po 12denní kultivaci byly nádobí fixovány 10% formalinem po dobu 30 minut při pokojové teplotě a obarveny 1% Rhodaminem B po dobu dalších 30 minut. Po promytí destilovanou vodou byly počty kolonií spočítány a analyzovány. Účinnost formování kolonií byla vyjádřena jako počet kolonií vytvořených děleno 200.
2.3. Test zdvojnásobení buněčné populace
limbální epiteliální buňky byly udržovány na krmné vrstvě 3T3 ošetřené mitomycinem C pomocí média FAD nebo média SR. Epitelové buňky byly trypsinizovány při dosažení 80-90% soutoku a pasážovány při hustotě 6 000 buněk / cm2. Kultury byly sériově udržovány po dobu 10 pasáží. Při každém průchodu byly odebrány limbální epiteliální buňky a počítány počty buněk. Počet zdvojnásobení populace (PD) pro každý průchod byl vypočítán podle následujícího vzorce: , kde představuje celkový počet buněk získaných v každém průchodu a představuje počet buněk pokovování na začátku.
2.4. Extrakce RNA a kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase
pro vyhodnocení úrovně genové exprese limbálních epiteliálních buněk byly provedeny PCR a PCR v reálném čase. Celková RNA byla extrahována z epiteliálních buněk rohovky pomocí sady RNeasy podle pokynů výrobce. RNA byla kvantifikována absorpcí při 260 nm a uložena při -80°C. K syntéze cDNA bylo použito 1 µg celkové RNA s reverzním transkripčním kitem Superscript III. PCR byla provedena pomocí Platinum PCR master mix (Life Technology); a PCR v reálném čase byla provedena pomocí SYBR Green PCR Master Mix (Roche) s dříve popsanými primery . Reakce PCR v reálném čase byly prováděny ve trojím vyhotovení s počátečním aktivačním krokem při 95°C po dobu 3 minut, následovalo 45 cyklů: 95°C po dobu 30 sekund, 60°C po dobu 30 sekund a 72°C po dobu 40 sekund. Relativní genová exprese byla vypočtena normalizací rozdílu v prahové hodnotě cyklu (delta Ct), hodnot genů na hodnotu delta Ct glyceraldehydy-3-fosfátdehydrogenázy (GAPDH).
2.5. Imunofluorescenční barvení
lidské limbální epiteliální buňky byly naočkovány do kultivačních sklíček s podávací vrstvou 3T3 v médiu FAD nebo SR médiu. Tři dny po zasetí byly kultury fixovány 4% paraformaldehydem nebo studeným acetonem při 4°C po dobu 10 minut. Po dvojnásobném promytí PBS byly buňky blokovány 5% kozím sérem v PBS po dobu 30 minut. Myší primární protilátky proti p63 (1 : 200, 4A4, Santa Cruz), ABCG2 (1 : 30, BXP-21, Millipore), K3 (1 : 400, Millipore) a connexinu 43 (1: 1000, Millipore) byly aplikovány a inkubovány přes noc při 4°C.Alexa Fluor 568-konjugovaná sekundární protilátka byla aplikována po dobu 1 hodiny po dvakrát promytí PBS. Buněčná jádra byla poté kontrastována Hoechst 33342 (1 µg / mL v PBS) po dobu 20 minut. Po promytí PBS po dobu 3krát byla buněčná kultura namontována s montážním médiem (Vector Laboratories, Burlingame, CA) a vyšetřena pod fluorescenčním mikroskopem (BX50; Olympus, Tokio, Japonsko).
2.6. Western Blot analýza
Kultivované limbální epiteliální buňky byly lyzovány RIPA pufrem (10 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% deoxycholát sodný, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA a koktejl inhibitoru proteázy; diagnostika Roche) na ledu po dobu 30 minut. Koncentrace proteinu byla kvantifikována pomocí proteinového testu kyseliny bicinchoninové (BCA) (Pierce, Rockford, IL). Celkové buněčné lyzáty (40 µg) byly elektroforovány v 12% gradientním gelu SDS-PAGE, přeneseny na nitrocelulózovou membránu (Bio-Rad), blokovány 5% odstředěným mlékem v Tris-pufrovaném fyziologickém roztoku (TBS) po dobu 1 hodiny a zkoumány myší protilátkami proti proliferujícímu antigenu buněčného jádra (PCNA, Santa Cruz, CA), ABCG2 (BXP-21, Millipore) nebo p63 (4A4, Santa Cruz, CA) přes noc při 4°C. membrány byly poté promyty třikrát s TBS, inkubované s kozím Anti-myším IgG (1 : 5000, HRP-konjugovaný, Santa Cruz, CA) nebo králičím Anti-kozím IgG (1 : 5000, HRP-konjugovaný, Santa Cruz, CA) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě a vyvinutý s vylepšenými chemiluminiscenčními substráty (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Hladiny exprese ABCG2, PCNA a p63 byly měřeny pomocí měření semikvantitativní intenzity a normalizovány na úroveň GAPDH, která sloužila jako vnitřní kontrola.
2.7. Statistika
souhrn dat CFE a relativní násobek PCR v reálném čase byl hlášen jako prostředek ± SD a porovnán pomocí Studentova nepárového testu s aplikací Microsoft Excel (verze 2003 / XP). Výsledky testů byly hlášeny jako dvouocasé hodnoty, kde byly považovány za statisticky významné.
3. Výsledky
3.1. Fenotyp epiteliálních kmenových buněk rohovky v médiu Sr
celkem 5 tkání rohovky a limbálního kruhu bylo odebráno od dárců ve věkovém rozmezí 32-65 let. Tyto tkáně byly konzervovány a zpracovány do 24 hodin po sklizni. Kultura primárních rohovkových epiteliálních buněk byla úspěšně nastavena také v médiu FAD (Obrázky 1(A) a 1 (b)) a SR médiu (Obrázky 1 (c) a 1 (d)). Epitelové buňky rohovky udržované v krmné vrstvě SR medium + 3T3 vykazovaly morfologii s malou velikostí a vysokým poměrem jader/cytoplazmy, což byla typická nediferencovaná morfologie epiteliálních buněk a velké diferenciační ploché dlaždicové buňky byly zřídka pozorovány (Obrázek 1(C)). Epitelové buňky udržované v médiu SR začaly tvořit kolonie 3 dny po setí (Obrázek 1(c)). Velikosti těchto kolonií byly podobné těm, které byly vytvořeny v krmné vrstvě fad medium + 3T3 (Obrázek 1(A)), ale tyto kolonie byly méně těsně zhutněny než v krmné vrstvě FAD + 3T3. Během 7 dnů dosáhly epitelové buňky soutoku v SR médiu s jednotnou malou velikostí (Obrázek 1(d)), což bylo také pozorováno v kultuře FAD (Obrázek 1 (b)). V této studii mohly být lidské epitelové buňky rohovky odvozeny a udržovány v SR medium + 3T3 feeder vrstva pro všech pět dárců. Pro dlouhodobou kultivaci byly lidské epiteliální buňky rohovky sériově subkulturovány v krmné vrstvě SR medium + 3T3 pro více než 10 průchodů (). Během každého průchodu byly buňky trypsinizovány a odebrány, když buňky dosáhly soutoku 80-90%; počty buněk byly vypočteny pro test zdvojnásobení populace. Výsledek ukazuje, že výtěžek epiteliálních buněk z média SR je blízký výtěžku buněk kultivovaných v médiu FAD, jak je znázorněno na obrázku 2(a), a tato data jsou podobná předchozím zprávám . Stručně řečeno, údaje zde uvedené ukazují, že SR kultivační médium + mitomycin C-ošetřené 3T3 feeder vrstva podporuje růst a proliferaci klonálních buněk epitelu lidské rohovky.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.2. CFE test
dále jsme zkoumali a porovnávali CFE epiteliálních buněk rohovky kultivovaných v médiích FAD a SR. Pro analýzu CFE byly epiteliální buňky rohovky kultivované v médiu SR a FAD sklizeny a naočkovány v hustotě 200 buněk na 100 mm Petriho misku, která byla předem připravena krmnou vrstvou 3T3 ošetřenou mitomycinem C a tato kultura byla ponechána růst po dobu 12 dnů. Epiteliální buňky rohovky začaly tvořit kolonie 5-7 dní po zahájení kultury. Jak je znázorněno na obrázku 2(b), po kultivaci po dobu 12 dnů vykazovaly epiteliální buňky rohovky udržované v médiu SR podobnou velikost CFE a kolonie ve srovnání s buňkami udržovanými v médiu FAD. Hodnota CFE pro epitelové buňky v médiu SR a FAD byla a (Obrázek 2(c)). Statistická analýza prokázala, že neexistují žádné významné rozdíly v účinnosti tvorby kolonií () a průměrné ploše kolonií () mezi médii SR a FAD (Obrázek 2(c)). Kvantifikovali jsme procento typů kolonií na základě plochy kolonií. Výsledky ukázaly, že procento abortivních kolonií (Plocha kolonie <1 mm2) vytvořených v médiu SR bylo podobné jako v médiu FAD (). Podobně procento velkých kolonií (Plocha kolonie >4 mm2) vytvořených v médiu SR bylo blízké procentu ve médiu FAD () (Obrázek 2(d)). Tyto výsledky naznačují, že epiteliální buňky rohovky kultivované v médiu SR mají podobný vyšší stupeň proliferačního potenciálu ve srovnání s buňkami pěstovanými v médiu FAD.
3.3. PCR a analýza PCR v reálném čase
ke studiu genové exprese byly PCR a PCR v reálném čase provedeny na epiteliálních buňkách kultivovaných v médiích FAD i SR. Housekeeping Gen GAPDH byl použit jako vnitřní kontrola. Data PCR ukazují, že buňka kultivovaná v médiu FAD i médiu SR vykazuje vysokou úroveň transkripční exprese proliferativního markeru PCNA. Buňky v obou médiích vykazují pozitivní expresi cytokeratinu 3 a cytokeratinu 12, což je v souladu s jejich limbovým původem. Pozitivní exprese markeru epiteliálních buněk bazální vrstvy, cytokeratinu 15, byla také pozorována v obou kulturách. V obou kulturách byla detekována exprese ABCG2 a ΔNp63α, ačkoli exprese ABCG2 po primární kultuře v SR médiu mírně poklesla. Nízká hladina exprese connexinu 43 byla pozorována v obou kulturách a implikovala nízkou úroveň diferenciace epiteliálních buněk v obou médiích. Pro PCR v reálném čase kvantitativní analýza hladiny mRNA ukázala, že mezi epiteliálními buňkami pěstovanými ve FAD a SR médii nebyl žádný významný rozdíl v expresi () p63 a ABCG2 (obrázek 4(a)). V reálném čase byla také provedena analýza markeru diferenciace rohovkového epitelu cytokeratinu 3 a cytokeratinu 12. Oba tyto dva markery byly sotva detekovatelné v kulturách FAD i SR buněk a překvapivě neexistuje žádný významný rozdíl () v úrovni exprese mezi těmito dvěma kulturami.
3.4. Imunofluorescenční barvení
k potvrzení, že epiteliální buňky pěstované v médiu SR udržovaly kmen a nediferencovaný stav, bylo provedeno imunofluorescenční barvení několika proliferačních, diferenciačních a domnělých markerů epiteliálních kmenových buněk. Jak je znázorněno na obrázku 4, v SR médiu, většina epiteliálních buněk vykazovala malou a jednotnou morfologii, a většina buněk byla silně obarvena P63, domnělý marker epiteliálních kmenových buněk. ABCG2 pozitivní obarvené buňky byly také pozorovány v nerovnoměrné distribuci v koloniích limbálních epiteliálních buněk. Buňky udržované v SR médiu byly slabě obarveny na connexin 43 a cytokeratin 3. Nízká exprese těchto dvou diferenciačních markerů naznačuje nízkou úroveň diferenciace epiteliálních buněk v buněčné kultuře. Podobný styl barvení byl také pozorován v buňkách udržovaných s médiem FAD (obrázek 4(b)). Tato data naznačují, že lidské limbální epiteliální buňky kultivované v médiu SR udržovaly expresi na vysoké úrovni domnělých markerů epiteliálních kmenových buněk, zatímco exprimuje nízkou úroveň diferenciačních markerů.
3.5. Western Blot
pro dvojnásobné potvrzení kvantitativní genové exprese a výsledků imunofluorescenčního barvení byla exprese potenciálních markerů epiteliálních kmenových buněk (p63 a ABCG2) a proliferační marker (PCNA) hodnocena pomocí western blot. Pomocí monoklonální protilátky p63 (klon 4A4, Santa Cruz) byl protein p63 (70 KD, izoforma ΔNα) detekován na vysoké úrovni exprese v SR médiu. Exprese ABCG2 (70 KD) byla detekována v každém průchodu buněk kultivovaných v SR médiu. PCNA, proliferační marker, byl také detekován v buňkách kultivovaných v SR médiu (obrázek 3(c)). A úrovně exprese p63, ABCG2 a PCNA byly podobné v 10 pasážích se semikvantitativním měřením intenzity (obrázek 3(d)) s použitím GAPDH jako vnitřní kontroly.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(a)
(b)
4. Diskuse
epitelové buňky Kultivované na krmné vrstvě 3T3 byly úspěšně odvozeny a použity k léčbě různých klinických situací, jako jsou těžké popáleniny, vředy diabetické nohy, kožní defekty a defekty ústní sliznice . První transplantace limbálních epiteliálních kmenových buněk byla popsána v roce 1997 Pellegrini et al. . Během posledních desetiletí bylo vyvinuto několik různých kultivačních metod, včetně kultury limbálních epiteliálních buněk na lidské amniotické membráně (HAM) s nebo bez krmné vrstvy 3T3, kultivace epiteliálních buněk na deskách reagujících na teplotu a kultivace epiteliálních buněk komerčním kultivačním médiem bez séra. Vzhledem k tomu, že nedávná zpráva naznačuje, že klinický výsledek transplantace epiteliálních buněk rohovky/limbu závisí na tom, zda jsou limbální kmenové buňky zachovány v buněčné kultuře, bylo zdůrazněno, že holoklony byly zachovány pouze v kultivačním systému FAD + 3T3 . Vzhledem k tomu, že tento kultivační protokol zahrnuje použití FBS, rostou obavy o bezpečnost, že FBS je špatně definovaný živočišný produkt a má potenciál přenášet choroby pocházející ze zvířat na pacienty . Proto je stále větší potřeba vyvinout kultivační médium bez živočišných produktů a bez FBS, které nahradí tradiční výstřelek .
v této studii jsme vyvinuli nové kultivační médium bez séra, ve kterém KnockOut SR nahradil FBS. Fenotypy limbálních epiteliálních kmenových buněk v tomto novém kultivačním médiu bez séra byly hodnoceny imunostainingem protilátkami pro navrhované markery kmenových buněk (p63, ABCG2) a diferenciační markery (cytokeratin 3, connexin 43).
jaderný transkripční faktor p63 byl dříve navržen jako marker epiteliálních kmenových buněk a ΔNα je převládající izoformou izoform p63 v těchto buňkách . Naše výsledky jsou v souladu s těmito předchozími zprávami; jaderný p63 byl silně exprimován v kultuře limbálních buněk, což bylo prokázáno imunostainingem, PCR v reálném čase a western blot. Přítomnost p63 v kultuře limbálních buněk naznačuje jejich vysoký proliferativní a seberealizační potenciál. ABCG2, člen transportérů ATP vazebné kazety (ABC), původně známý jako protein 1 rezistentní na rakovinu prsu (BCRP1), byl navržen jako další domnělý marker kmenových buněk pro dospělé kmenové buňky, včetně limbusových epiteliálních kmenových buněk . Vysoká exprese ABCG2 v médiu SR byla prokázána imunostainingem a PCR v reálném čase.
K3 a K12 jsou dobře známé jako markery specifické pro rohovku . Důsledně naše imunostaining a výsledky PCR v reálném čase ukázaly, že buňky byly K3 a K12 negativní, což potvrdilo jejich původ limbu. Connexin 43 je členem rodiny proteinů gap junction; umožňuje přímou difúzi nízkomolekulárních rozpuštěných látek mezi sousedními buňkami. Bylo hlášeno, že Connexin 43 je exprimován diferencovanými epiteliálními buňkami a nepřítomnost těchto mezibuněčných komunikačních molekul může být znakem epiteliálních kmenových buněk.
v našich výsledcích větší procento buněk exprimovalo p63 a ABCG2, zatímco jen málo buněk exprimuje diferenciační markery K3 / K12 a CX43. Lidské limbální epiteliální kmenové buňky v médiu bez séra SR tedy vykazovaly podobné fenotypy a udržovaly nediferencované podmínky ve srovnání s médiem FBS.
na závěr, pomocí KnockOut SR nahrazující FBS, naše nové médium bez séra udržuje růst a proliferaci epiteliálních buněk lidské rohovky a zachovává epiteliální kmenové buňky v jejich nediferencovaném fenotypu. Tato nová kultivační metoda bez séra je definována jako doplněk a relativně snadno se ovládá. Má velký potenciál pro použití při transplantaci limbálních epiteliálních buněk a regeneraci tkání.
konkurenční zájmy
autoři prohlašují, že nemají žádné konkurenční zájmy.
poděkování
tato práce byla podpořena grantem z Jilin University a National Natural Science Foundation of China (NSFC 30500548).
