strukturní základ pro rozpoznání K48-vázaného Ub řetězce proteazomálním receptorem Rpn13

K48-vázaný Ub řetězec dynamicky kolísá mezi více konformacemi

použili jsme smFRET k posouzení prostorového uspořádání dvou podjednotek Ub v K48-diubu bez ligandu. Zavedli jsme fluorofory, Alexa Fluor 488 a Cy5, na n-konci distálního Ub a C-konci proximálního Ub (Doplňkový obr. S1a). Pomocí algoritmu maximalizace očekávání32 lze profil smFRET K48-diUb nejlépe popsat jako tři překrývající se druhy pražců (Doplňkový obr. S2). Druhy s vysokým, středním a nízkým pražcem jsou soustředěny s účinností pražců 0,74, 0,57 a 0,23, s příslušnými populacemi ~48, ~39 a ~13% (obr. 1a). Vzdálenosti pražců mezi středem fluoroforů se počítají na ~43, ~50, ~64 Å. Proto mohou být druhy s vysokým, středním a nízkým pražcem přiřazeny k kompaktním, polootevřeným a otevřeným stavům, které již existují pro K48-diUb.

a s fluorofory konjugovanými v 76 C místě proximálního Ub a 0 C distálního Ub (srov. Doplňkový Obr. S1A), profil smFRET lze namontovat na tři překrývající se druhy pražců. Pokud není uvedeno jinak, tato dvojice konjugačních míst se používá pro všechny studie smFRET K48-diUb. Druh s vysokým pražcem (červená barva) odpovídá již existujícímu kompaktnímu stavu. B-d kompaktní stav může být selektivně obohacen o Rpn13 v plné délce, a nárůst populace může být namontován na vazebnou izotermu. e-g kompaktní stav může být selektivně obohacen Rpn13NTD, a nárůst populace může být namontován jako závazný izoterm. h S fluorofory konjugovanými v místech N25C/N25C může Rpn13NTD selektivně obohatit již existující kompaktní stav distálního diubu K48-tetraUb (srov. Doplňkový Obr. S5), poskytující vazebnou afinitu. Populace druhů smFRET jsou zprůměrovány na tři nezávislá měření s chybami označujícími 1 SD; hodnoty KD jsou uváděny jako chyby best fit ± fitting

konformační fluktuace K48-diUb byla dříve zkoumána pomocí smFRET26. V této studii autoři vyřešili dva druhy smFRET pro K48-diUb, jmenovitě druhy s vysokým pražcem a s nízkým pražcem s účinností středu pražce na 0.69 a 0.41, kromě druhu bez pražce. Autoři ukázali, že titrace inaktivované OTUB1 (OTUB1i), deubikvitinázy specifické pro isopeptidové spojení K4833, obohacuje hlavně druhy s nízkým pražcem. Jejich pozorování vedlo k návrhu, že K48-diUb může být specificky rozpoznán OTUB1 prostřednictvím konformačního výběrového mechanismu. Zde jsme zopakovali titraci smFRET a zjistili jsme, že OTUB1i obohacuje středně pražce (Doplňkový obr. S3a-c). Populační nárůst středně PRAŽCOVÝCH druhů po titraci OTUB1i lze navíc přizpůsobit vazebnému izotermu s hodnotou KD 7,7 ± 0.1 µM (Doplňkový obr. S3d), který se blíží dříve hlášené hodnotě kd26. Tím pádem, druhy středních pražců v této studii by měly odpovídat druhům s nízkým pražcem v předchozí studii,a rozpor může vyplynout z různých účinností počítání fotonů a montážních rutin časových Stop smFRET.

abychom dále potvrdili, že K48-diUb kolísá mezi třemi již existujícími konformačními stavy, zavedli jsme fluorofory na další páry konjugačních míst fluoroforů (Doplňkový obr. S1b-d). U alternativních lokalit, i když se středová účinnost druhů pražců liší, lze profily smFRET stále popsat jako tři překrývající se druhy pražců s podobnými populacemi (Doplňkový obr. S4). Například pro konjugační místa 25 C / 25 C jsou druhy s vysokým, středním a nízkým pražcem soustředěny s účinností pražců 0,68, 0,54 a 0,21, s příslušnými populacemi ~48%, ~43% a ~9% (Doplňkový obr. S4d). Proto je nepravděpodobné, že by konjugace fluoroforů narušila strukturu proteinu a měření smFRET odhalila inherentní konformační dynamiku K48-diUb bez ohledu na konjugační místo, to znamená, že K48-diUb se střídá mezi třemi odlišnými stavy v nepřítomnosti partnerského proteinu.

abychom dále posoudili, zda Ub podjednotky v delším řetězci Ub vázaném na K48 také kolísají mezi více konformačními stavy, analyzovali jsme profil smFRET Tetra-ubichitinu vázaného na K48 (K48-tetraUb). Fluorofory jsme konjugovali na dvou místech N25C v distálním diubu (s respektem k proximálnímu diubu) K48-tetraubu. Profil smFRET může být také vhodný jako tři překrývající se druhy pražců (Doplňkový obr. S5a). Ačkoli relativní populace těchto tří druhů se liší od populace izolovaného K48-diubu s fluorofory konjugovanými na stejných místech (Doplňkový obr. S4D), středové pražce druhu pražce jsou téměř totožné. Konformační stavy jednotky diUb jsou tedy pravděpodobně zachovány v delším řetězci Ub spojeném s K48, zatímco rozdíl v relativních populacích může být výsledkem modulačního účinku proximálního diubu.

druh s vysokým pražcem je selektivně obohacen Rpn13

pro posouzení vztahu mezi konformační dynamikou řetězce Ub spojeného s K48 a rozpoznáváním Rpn13 jsme titrovali 150 pM fluoroforem značený K48-diUb s lidským proteinem rpn13 v plné délce. Zajímavé je, že po přidání 100 nM Rpn13 je již existující druh K48-diUb s vysokým pražcem obohacen z ~48% na ~57% (obr. 1a, b), zatímco populace středních a nízkých pražců klesá. Populace druhů s vysokým pražcem se stále zvyšuje s přidáním více Rpn13 (obr. 1c) a vazebná izoterma může být namontována na hodnotu KD 119 ± 24 nM (obr. 1d).

již dříve bylo prokázáno, že Rpn13NTD je hlavně zodpovědný za vázání UB6, 7. Provedli jsme tedy titraci smFRET pro 150 pM fluoroforem značený K48-diUb za použití pouze Rpn13NTD obsahující pouze prvních 150 zbytků. Rpn13NTD také selektivně obohacuje druh K48-diUb s vysokým pražcem (obr. 1e, f). Populační nárůst druhů s vysokým pražcem lze přizpůsobit hodnotě KD 33,1 ± 6,9 nM (obr. 1g), což je asi 4násobné zvýšení afinity ve srovnání s Rpn13 v plné délce. Pokud jsou fluorofory připojeny na alternativních konjugačních místech (Doplňkový obr. S1B a S4b), titrace Rpn13NTD také způsobuje obohacení ekvivalentních druhů pražců po podobném trendu, což poskytuje téměř identickou hodnotu KD (Doplňkový obr. S6). To znamená, že vzhled další zbytky mohou mít malý inhibiční účinek na interakci mezi Rpn13NTD a K48-diUb.

dále jsme provedli titraci smFRET na 150 pM K48-tetraUb s fluorofory konjugovanými na distálním diubu (Doplňkový obr. S5a). Titrace Rpn13NTD selektivně obohacuje již existující druhy s vysokým pražcem distálního diubu značeného fluoroforem (Doplňkový obr. S5b-d)a vazebnou izotermu lze namontovat na hodnotu KD 214 ± 70 nM (obr. 1h). 7násobné snížení vazebné afinity ve srovnání s interakcí Rpn13NTD:K48-diUb lze přičíst vlastní asociaci mezi distálním diubem a proximálním diUb34, čímž je vazebný povrch méně dostupný pro vazbu Rpn13. Důležité je, že pro všechny titrace smFRET K48-diUb nebo K48-tetraUb se středová účinnost druhů s vysokým pražcem mění jen málo v nepřítomnosti nebo přítomnosti Rpn13 nebo Rpn13NTD. To znamená, že Rpn13 se váže na již existující konformaci K48-diUb prostřednictvím konformačního selekčního mechanismu, ať už je K48-diUb sám o sobě nebo je součástí delšího řetězce Ub. To také znamená, že druh s vysokým pražcem, tj. již existující kompaktní stav K48-diUb, není zcela uzavřen a je připraven k interakci s jinými proteiny. Důležité je, že selektivní obohacení druhů s vysokým pražcem také naznačuje, že Rpn13 by měl interagovat s oběma podjednotkami Ub současně.

Rpn13 se přednostně váže na K48-vázaný diUb

abychom vyhodnotili vazebnou specificitu rpn13 pro vazbu K48, vyhodnotili jsme vazebné afinity mezi Rpn13 a jinými typy proteinů Ub. Při titraci 200 nM Rpn13NTD na 150 pM fluoroforem značený K48-diUb se populace druhů s vysokým pražcem zvyšuje o 15% z ~48% na ~63% (obr. 1f). Při této koncentraci není vazba K48-diUb dosud nasycena Rpn13NTD (obr. 1g), a proto je populace druhů s vysokým pražcem citlivá na malou změnu dostupné koncentrace Rpn13NTD. Neoznačený K48-diUb může soutěžit o vazbu na Rpn13NTD s fluoroforem značeným K48-diUb. S přidáním 150 pM neoznačeného K48-diubu se populace druhů s vysokým pražcem snižuje o 7,5%, což odpovídá 50% inhibici Rpn13NTD vázaného fluoroforu značeného K48-diUb (obr. 2a). S přidáním 300 pM neoznačených K48-diUb se populace druhů s vysokým pražcem snižuje o 11%, což představuje celkem 73% inhibici (obr. 2b). Jako takový, jak fluoroforem značený, tak neoznačený K48-diUb soutěží o stejné vazebné rozhraní na Rpn13 s podobnou vazebnou afinitou. To také znamená, že konjugace fluoroforů na K48-diUb způsobuje malou poruchu interakce mezi Rpn13NTD a K48-diUb.

a, B přídavek 200 nM Rpn13NTD nejprve obohacuje vysoce PRAŽCOVÝ druh fluoroforu značeného K48-diUb (srov. Obrázek 1f), a další přidání 150 pM a 300 pM neoznačené K48-diUb snižují populaci vysoce PRAŽCOVÝCH druhů. C, D přidání 150 pM a 300 pM neoznačený monomer Ub má zanedbatelný vliv na populaci druhů s vysokým pražcem. e, f přidání 150 pM K48-diUb a 150 pM M1-diUb způsobuje velmi malý pokles populace druhů s vysokým pražcem

dále jsme ke směsi 200 nM Rpn13NTD a 150 pM fluoroforem značeného K48-diubu přidali neoznačený Ub monomer, K63-vázaný diubichitin nebo M1-vázaný diubichitin, abychom posoudili, zda jiné typy Ub mohou vytěsnit K48-diUb. Populace druhů s vysokým pražcem se mění jen málo přidáním monomeru 150 pM nebo 300 pM Ub (obr. 2c, d). S přidáním 150 pM K63-diUb a 150 pM M1-diUb se populace druhů s vysokým pražcem také nezmění v rozsahu chyb (obr. 2e, f). Na druhé straně přímá titrace 1 µM Rpn13NTD na fluorofor-konjugovaný K63-diUb a M1-diUb způsobuje malou změnu jejich již existujících profilů smFRET (Doplňkový obr. S7). Společně Rpn13NTD selektivně interaguje s K48-diUb.

struktura řešení Rpn13NTD:K48-diUb komplex

ačkoli jsme nyní ukázali, že Rpn13NTD selektivně interaguje s K48-diUb, byla stanovena pouze složitá struktura mezi rpn13ntd a UB monomerem 6, 8. Abychom pochopili, jak mohou obě podjednotky v K48-diUb současně interagovat s Rpn13NTD, rozhodli jsme se určit strukturu řešení komplexu Rpn13NTD:K48-diUb pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR). Při tvorbě proteinového komplexu by mezifázové zbytky zažívaly odlišné místní prostředí,a proto by zobrazovaly signály NMR. Zjistili jsme, že titrace neoznačeného K48-diubu na 15N značený Rpn13 způsobuje velké perturbace chemických směn (CSP), které zahrnují hlavně zbytky 73-83 a 93-106 (obr. 3a). Tyto zbytky tvoří přilehlý povrch na Rpn13, pokrývající plochu větší, než se očekávalo od dříve stanovené komplexní struktury mezi Rpn13NTD a Ub monomer6, 7. Na druhé straně titrace neoznačeného Rpn13NTD na K48-dUb, s buď proximální nebo distální Ub 15N-značenou a druhou podjednotkou neoznačenou, CSP jsou pozorovány hlavně pro rezidua v oblasti β-listu obou podjednotek Ub. Některé mezifázové zbytky také zmizely při tvorbě komplexu (obr. 3b, c).

a-c CSP průměrně přes 1h a 15N rozměry páteřních amidových protonů při tvorbě komplexu s 0,2 mM izotopem značenými a neznačenými proteiny. Vložky: podjednotka označená 15N je znázorněna povrchovou reprezentací a zbytky červené barvy mají CSP nad tečkovanou čarou. d, e s paramagnetickou sondou konjugovanou v místě e24c distálního Ub byly poměry intenzity mezi paramagnetickým a diamagnetickým spektrem a hodnoty pre Γ2 hodnoceny pro páteřní amidové protony Rpn13NTD značené 15N. Šedé krabice označovaly zbytky s velmi velkými intermolekulárními PREs. f s paramagnetickou sondou konjugovanou v místě n25c proximálního Ub byly měřeny hodnoty Γ2 pro amidové protony 15N značené distální Ub v K48-diUb. Chybové pruhy označují 1 S. D., a zbytky zcela rozšířené v komplexu jsou označeny hvězdami

jaderný Overhauserův efekt (NOE) hlásí vztah vzdálenosti (<6 Å) mezi jádry. Navíc 13C polofiltrovaný NMR experiment může poskytnout NOE mezi 12C-vázaným protonem a 13C-vázaným protonem, tj. Získali jsme intermolekulární Noe mezi Rpn13NTD a proximálním Ub, mezi Rpn13NTD a distálním Ub a mezi proximálním Ub a distálním Ub (Doplňkový obr. S8). Dále jsme konjugovali paramagnetickou sondu maleimide-EDTA-Mn2+ v místě e24c distálního Ub a shromáždili paramagnetické relaxační vylepšení (PRE)pro páteřní amidové protony Rpn13NTD podle zavedeného protokolu22,35. Jak bylo hodnoceno buď poměrem maximální intenzity paramagnetických versus diamagnetických spekter, nebo rychlostí Γ2 s příčným zlepšením relaxace, rezidua rpn13 30-42 a 101-106 vykazují velké PREs s těžkým rozšířením linie (obr. 3d, e). Také jsme konjugovali paramagnetickou sondu v místě n25c proximálního Ub a vyhodnotili rychlost zvýšení příčné relaxace Γ2 pro distální Ub (obr. 3f). Velké hodnoty PRE jsou pozorovány mezi dvěma Ub podjednotkami K48-diUb bez ligandu a přidání Rpn13NTD zvyšuje Inter-Ub PREs, ale s podobným profilem PRE. Experimenty před NMR tak potvrzují, že Rpn13NTD obohacuje již existující kompaktní stav K48-diUb.

upřesnit rpn13ntd:K48-diUb komplexní struktura proti experimentálním omezením, provedli jsme pevné dokování těla s volností úhlu torze danou zbytkům diUb linker a bočním řetězcům mezifázových zbytků. Pro 20 konformátorů s nejnižší energií je odchylka mezi kořenovým a středním čtvercem (RMS) pro těžké atomy páteře všech tuhých zbytků 0,86 ± 0,54 Å (Doplňkový obr. S9 a tabulka S1). Dvě podjednotky Ub K48-diUb zůstávají spojeny v komplexu a pohřbívají solventní přístupnou povrchovou plochu (SASA) ~1130 Å2. Na druhé straně se rpn13ntd zaklíní a pohřbí ~940 Å2 SASA s proximálním Ub a ~1300 Å2 SASA s distálním Ub (obr. 4a). Složitá struktura mezi Rpn13NTD a proximálním Ub K48-diUb v této studii je podobná známé komplexní struktuře mezi rpn13ntd a UB monomer6, 7, s rozdílem RMS pro páteřní těžké atomy 2.17 ± 0.31 Å (Doplňkový obr. S10a). Zajímavé je, že ačkoli hydrofobní zbytky L8, I44 a V70 v proximálním Ub jsou zapojeny do interakce s Rpn13, stejné tři zbytky v distálním Ub jsou pohřbeny v rozhraní Ub-Ub.

struktura komplexu Rpn13NTD: K48-diUb. Tvorba komplexu pohřbívá rozsáhlé rozhraní mezi podjednotkami. b plochy elektrostatického potenciálu rpn13ntd a distální Ub K48-diUb, nakreslené v měřítku ± 3 kBT. Zbytky R104 v Rpn13NTD a D39 v distální Ub jsou zobrazeny jako kuličky a tyčinky. mutace obrácení náboje c R104E v Rpn13NTD způsobuje 300násobné snížení vazebné afinity K48-diUb, jak bylo hodnoceno smFRET (srov. Doplňkový Obr. S11). Hodnota KD se udává jako nejvhodnější ± chyby při montáži. d Western blot analýzy ukazují, že transfekce rpn13 r104e mutantu (s n-terminálním příznakem) zvyšuje celkové množství polyUb proteinů vázaných na K48 v buňce. viability buněk při tepelném šoku (vzhledem k buňkám bez tepelného šoku) ukazují, že transfekce mutantu Rpn13 R104E, ale ne divokého typu Rpn13, poskytuje termotoleranci. * P < 0,05, * * * P < 0.001, pro kontrolu buněk ve stejné skupině, nepárový t-test; # # P < 0,01, ## # P < 0,001, do neošetřených buněk s tepelným šokem, jednosměrná ANOVA; && P < 0.01, &&&P < 0,001, na wildtype rpn13 transfektované buňky s tepelným šokem, jednosměrná ANOVA

komplexní struktura Rpn13NTD:K48-diUb může být také potvrzena daty pražce s jednou molekulou. Na základě komplexní struktury jsme modelovali fluorofory na jejich konjugačních místech v K48-diUb. Průměrná vzdálenost je 43,2 ± 5.8 Å mezi geometrickými středy fluoroforových aromatických kruhů, což odpovídá teoretické účinnosti pražce 0,73 ± 0,13 (Doplňkový obr. S10b). Tato hodnota je téměř stejná jako účinnost středu pozorovaná u druhů s vysokým pražcem (obr. 1a).

narušení Rpn13NTD: distální interakce Ub způsobuje akumulaci ubikvitinovaných proteinů v buňce

v komplexní struktuře mezi Rpn13NTD a K48-diUb, interakce mezi Rpn13NTD a proximálním Ub je podobná interakci mezi rpn13ntd a Ub monomerem, jak bylo dříve uvedeno (Doplňkový obr. S10a). Proto jsme navrhli experimenty k posouzení funkčního významu pro interakci mezi Rpn13NTD a distálním Ub K48-diUb. Mnoho nabitých zbytků je umístěno na rozhraní mezi Rpn13NTD a distálním Ub K48-diUb, a proto může elektrostatická síla hrát důležitou roli pro stabilizaci komplexu (obr. 4b). Mezi nimi je reziduum D39 v distální Ub blízké reziduu R104 v Rpn13. Tím jsme zmutovali rpn13 zbytek R104 na glutamát a titrovali mutant Rpn13NTD na fluoroforem značený K48-diUb. Mutantní protein obohacuje vysoce PRAŽCOVÝ druh K48-diUb (Doplňkový obr. S11). Vazebná afinita se však stává mnohem slabší. Vazebná izoterma může být namontována na hodnotu KD 10,0 ± 3,3 µM, asi 300krát slabší než divoký typ Rpn13NTD (obr. 4c). Spojení s distálním Ub je proto důležité pro specifické rozpoznávání mezi Rpn13 a K48-diUb.

snížená vazebná afinita mutantu R104E nám umožnila posoudit funkční význam interakce mezi řetězcem Ub spojeným s Rpn13 a K48. Přechodná transfekce wildtypu Rpn13 mírně zvyšuje množství polyUb proteinů spojených s K48 (obr. 4d). Je možné, že při transfekci Rpn13 nadměrné množství volného Rpn13 soutěží o vazbu na polyUb proteiny vázané na K48 s Rpn13 spojeným s proteazomem, čímž je nábor ubikvitinovaných substrátových proteinů do proteazomu méně účinný. Na druhé straně transfekce mutantu Rpn13 R104E výrazně zvyšuje množství polyUb proteinů vázaných na K48 ve srovnání s buňkami transfekovanými wildtypem Rpn13 (obr. 4d). Jako pozitivní kontrolu jsme inkubovali buňky s 1 µM MG132, silným inhibitorem proteazomu36. V důsledku zablokování degradace labilních proteinů přidání MG132 významně zvyšuje množství polyubových proteinů spojených s K48. Dohromady může mutace R104e Rpn13 vést k akumulaci ubikvitinovaných substrátových proteinů. To lze přičíst slabší interakci mezi mutantem rpn13 spojeným s proteazomem a K48-diubem a K48-poyubem.

tepelný šok může snížit životaschopnost buněk. Zjistili jsme, že 30 min tepelný šok při 43 °C může snížit životaschopnost buněk HEK293 na 75%. Podobně jako v předchozích zprávách36, 37 jsme také zjistili, že léčba MG132 má ochranný účinek na přežití buněk při tepelném šoku, přičemž životaschopnost buněk se snížila na ~90% (obr. 4e). Je to proto, že MG132 inhibuje proteazomální degradaci, čímž jsou k dispozici jinak krátce žijící proteiny tepelného šoku (obr. 4d). Také jsme testovali životaschopnost teplem šokovaných buněk transfektovaných wildtypem Rpn13 a nezjistili jsme žádný významný rozdíl od kontrolních buněk bez transfekce Rpn13. Na druhé straně se buněčná životaschopnost transfekovaných buněk Rpn13 R104E snížila na ~83% při tepelném šoku, což je významně vyšší než životaschopnost kontrolních buněk a buněk transfekovaných divokým typem Rpn13 (obr. 4e). To znamená, že mutant Rpn13 má ochranný účinek na přežití buněk při tepelném šoku, podobný účinku MG132. Dohromady je interakce mezi rpn13 a K48-vázaným řetězcem Ub nezbytná pro rozpoznávání ubikvitinovaných substrátových proteinů zprostředkovaných rpn13 proteazomem, zatímco interfaciální bodová mutace v Rpn13 může způsobit akumulaci určitých substrátových proteinů, jako jsou proteiny tepelného šoku, a propůjčovat termotoleranci transfekovaným buňkám.

rpn13ntd: interakce K48-diUb může být zaměřena na modulaci funkce Rpn13

Rpn13 je dynamicky přijímán do proteazomu prostřednictvím interakce mezi Rpn13NTD a C-koncovým ocasem Rpn27, 13. Složitá struktura zde naznačuje, že vazebné rozhraní na Rpn13NTD pro Rpn2 je blízké, ale nepřekrývá se s vazebným rozhraním pro distální Ub K48-diUb (obr. 5a). Takto jsme premixovali posledních 16 zbytků Rpn2 (Rpn2CTD) s Rpn13NTD nebo s rpn13 v plné délce v poměru 1:1 a titrovali komplex Rpn13NTD:Rpn2CTD na fluoroforem značený K48-diUb. Premixování Rpn2CTD zvýšilo hodnotu KD rpn13ntd:K48-diUb z 33,1 ± 6,9 nM (obr. 1 g) až 66,8 ± 13,9 nM (Doplňkový obr. S12a-c a obr. 5b), zatímco se snížila hodnota KD Rpn13: K48-diUb ze 119 ± 24 nM (obr. 1d) až 43,9 ± 12,8 nM (Doplňkový obr. S12d-f a obr. 5c). Tím, že poskytuje nejistoty měření, způsobuje asociace Rpn2CTD pouze malou odchylku pro vazebnou afinitu mezi Rpn13 a K48-diUb, což může také souviset s přítomností linker a C-terminální doména Rpn13.

a vazebná Plocha distálního Ub K48-diubu na Rpn13NTD sousedí s vazebnou plochou Rpn2CTD. S komplexní strukturou Rpn13NTD-Rpn2CTD (PDB kód 5V1Y) překrytou Rpn13NTD je Rpn2CTD zobrazen jako červená karikatura. Rpn13 zbytek K34 je blízko C-konce distální Ub (znázorněno jako tečkovaná čára). B, C vazebné afinity byly získány z titrací smfret ekvimolárního rpn13ntd:Rpn2CTD nebo Rpn13: Rpn2CTD na fluoroforem značený K48-diUb. Hodnoty KD jsou uváděny jako chyby best fit ± fitting. D vazba monomeru Ub ukotveného Rpn2 pravděpodobně zaujímá stejnou vazebnou plochu distálního Ub, což způsobuje jeho posunutí. e, f soutěžní experimenty smFRET s dalším přidáním fúzního proteinu 150 pM Rpn2CTD-Ub ke směsi 200 nM Rpn13NTD nebo rpn13 v plné délce a 150 pM fluoroforem značeného K48-diubu (c. f. obrázek 1c a f). Chyba označuje 1 S. D. ze tří nezávislých měření populací druhu smFRET

Rpn2 a distální Ub K48-diUb zabírají blízké povrchy na Rpn13NTD. Proto fúzní protein s Ub monomerem připojeným na C-konci Rpn2CTD může vyčnívat a interferovat s interakcí mezi Rpn13NTD s distálním Ub K48-diUb (obr. 5d). Jak jsme ukázali, přidání 200 nM Rpn13NTD zvyšuje populaci vysoce PRAŽCOVÝCH druhů 150 pM fluoroforem značených K48-diUb na ~63% (obr. 1f), zatímco přidání Ub monomeru nemůže konkurovat vazbě Rpn13NTD (obr. 2c, d). Když jsme přidali další 150 pM neoznačený fúzní protein Rpn2CTD-Ub, populace druhů s vysokým pražcem klesá o ~4% na ~59% (obr. 5e). Na druhé straně jsme ukázali, že přidání 200 nM plné délky Rpn13 zvyšuje populaci vysoce PRAŽCOVÝCH druhů 150 pM fluoroforem značených K48-diUb na ~60% (obr. 1c). Další přidání 150 pM neoznačeného fúzního proteinu Rpn2CTD-Ub snižuje populaci druhů s vysokým pražcem o ~4, 5 až ~55, 5% (obr. 5f). Všimněte si, že připojení Ub na Rpn2CTD nemá téměř žádný vliv na interakci mezi Rpn2CTD a Rpn13NTD (Doplňkový obr. S13). Naše data tedy naznačují, že rozhraní pro vazbu Rpn2 a K48-diUb na Rpn13NTD jsou blízko sebe. Ještě důležitější je, že Ub ukotvená v Rpn2 může fyzicky blokovat přístup distálního diubu k Rpn13 a oslabit interakci mezi K48-diubem a Rpn13.