1. KRAS exon 2 (kodony 12/13) a exon 3 (kodon 61) testování mutací: Cobas® KRAS mutační Test pro diagnostické použití In Vitro (Roche).
mutační Test Cobas® KRAS je PCR test v reálném čase pro kvalitativní detekci somatických mutací v exonu 2 (kodony 12/13) a exonu 3 (kodon 61) genu KRAS pomocí vstupu DNA 100 ng. Test dokáže detekovat 19 mutací KRAS. Přítomnost mutací je detekována s analytickou specificitou nejméně 99% a detekčním limitem nejméně 5% hladiny mutantů na pozadí genomové DNA divokého typu.
test mutace Cobas® KRAS je založen na dvou hlavních procesech: (1) ruční příprava vzorku k získání genomové DNA z jedné nebo dvou 5 µm tlustých částí tkáně FFPE CRC obsahující alespoň 10% nádorových buněk; (2) PCR amplifikace cílové DNA pomocí komplementárních párů primerů a dvou oligonukleotidových sond označených fluorescenčním barvivem. Použité páry primerů definují sekvenci 85 párů bází pro exon 2 obsahující kodony KRAS 12 a 13 a sekvenci 75 párů bází pro exon 3 obsahující kodon kras 61 v lidské genomové DNA. Jedna sonda je určena k detekci sekvence KRAS kodonu 12/13 v exonu 2 a druhá sonda je určena k detekci sekvence KRAS kodonu 61 v exonu 3 genu KRAS. Detekce mutací je dosažena analýzou křivky tavení analyzátorem Cobas z 480 (1).
2. KRAS Mutation Test v2 (LSR)
KRAS Mutation Test v2 (LSR) je alela-specifický, real-time PCR test pro kvalitativní detekci a identifikaci exon 2, 3 a 4 mutací v genu v-Ki-ras2 Kirsten rat sarkom virový onkogen homolog (KRAS) z formalinem fixované tkáně s parafinem (FFPET). Test je určen k detekci 28 jedinečných mutací. Přítomnost mutací je detekována s analytickou specificitou nejméně 99% a detekčním limitem nejméně 1% hladiny mutantů na pozadí genomové DNA divokého typu.
test mutace kras v2 (LSR) je založen na dvou procesech: (1) ruční příprava vzorku k získání genomové DNA z FFPET; a (2) amplifikace PCR a detekce cílové DNA pomocí komplementárních párů primerů a oligonukleotidových sond značených fluorescenčními barvivy.
test mutace kras v2 (LSR) používá primery, které definují specifické sekvence párů bází pro každou z cílených mutací. K amplifikaci dochází pouze v oblastech genu KRAS mezi primery; celý gen není amplifikován. Cílené sekvence KRAS se pohybují od 79 do 114 párů bází. Detekce mutací je dosažena pomocí PCR analýzy pomocí analyzátoru Cobas z 480. (1)
3. BRAF / NRAS Mutation Test (LSR)
BRAF/Nras Mutation Test (LSR) je alelově specifický PCR test v reálném čase pro kvalitativní detekci a identifikaci mutací exonu 11 a 15 v genu protoonkogen B-Raf (BRAF) a mutací exonu 2, 3 a 4 v genu neuroblastomu RAS virového onkogenu homolog (NRAS) z formalinem fixované tkáně vložené do parafinu (FFPET).
test je určen k detekci 36 jedinečných mutací. Přítomnost mutací je detekována s analytickou specificitou nejméně 99% a detekčním limitem nejméně 5% hladiny mutantů na pozadí genomové DNA divokého typu.
test mutace BRAF/NRAS (LSR) je založen na dvou hlavních procesech: (1) ruční příprava vzorku k získání genomové DNA z FFPET; a (2) amplifikace PCR a detekce cílové DNA pomocí komplementárních párů primerů a oligonukleotidových sond značených fluorescenčními barvivy.
BRAF/NRAS Mutation Test (LSR) používá primery, které definují specifické sekvence párů bází pro každou z cílených mutací. K amplifikaci dochází pouze v oblastech genů BRAF nebo NRAS mezi primery; celý gen není amplifikován. Sekvence BRAF se pohybují od 101 do 120 párů bází. Nras sekvence se pohybují od 94-121 párů bází. Detekce mutací je dosažena pomocí PCR analýzy pomocí analyzátoru Cobas z 480. (2)
klinické důsledky
KRAS a NRA jsou blízce příbuznými členy rodiny RAS onkogenu a mutace v obou genech na kodonech 12, 13 (exon 2), kodonu 61 (exon 3) a kodonu 146 (exon 4) vedou ke zvýšeným hladinám proteinů Ras vázaných na guanosin trifosfát. Hyperaktivní signalizace RAS podporuje onkogenezi. U kolorektálního karcinomu (CRC) se mutace KRAS a NRAS v těchto kodonech vyskytují až v 50% případů a předpovídají nedostatečnou odpověď na anti-EGFR terapii. Většina mutací RAS jsou bodové mutace vyskytující se v KRAS exon 2 (kodony 12 nebo 13; asi 40%). Jiné mutace RAS jsou méně časté u nejčastějších mutací vyskytujících se v EXONECH KRAS 3 a 4 a exonech NRAS 2 a 3 (3).
asi 50% melanomů má aktivační mutace v BRAF. Více než 90% mutací BRAF vede ke změně nukleotidu 1799 T>vedoucí k substituci kyseliny valin-glutamové v poloze 600 (V600E). Mutace BRAF V600E způsobuje nekontrolovanou signalizaci dráhy MAPK vedoucí k nadměrnému růstu a proliferaci buněk. Látky zaměřené na aktivovaný mutant BRAF (inhibitory BRAF) se ukázaly jako úspěšné u pacientů s metastazujícím melanomem, který tuto mutaci skrývá (1-3).
kromě své prediktivní hodnoty u melanomu má mutace BRAF V600E také prognostickou hodnotu u kolorektálního karcinomu a rakoviny plic (NSCLC) (4,5,7). Mutace BRAF V600E se nachází asi u 10% metastatického kolorektálního karcinomu a byla spojena s přítomností mikrosatelitové nestability (6). Celkově mají pacienti s CRC mutovaným BRAF nízkou míru odpovědi na konvenční terapie a nepříznivou prognózu. Zatímco melanomy mutované BRAF V600 jsou citlivé na inhibitory BRAF, CRC mutované BRAF V600 nemusí být tak citlivé. Aktivace EGFR u kolorektálního karcinomu by mohla vysvětlit, proč mají kolorektální karcinomy obecně nižší odpověď na inhibitory BRAF. Proto se doporučuje zahájit kombinovanou léčbu inhibitory EGFR a BRAF.
mutace BRAF V600E se také vyskytuje u 3-5% všech rakovin plic (7). Zatímco inhibitory BRAF se ukázaly jako úspěšné u pacientů s NSCLC pozitivních na mutaci v600e, FDA schválila použití kombinované terapie s inhibitorem BRAF a mek pro pacienty s NSCLC s mutací v600e na základě výsledků mezinárodní, multicentrické, tří kohortové, nerandomizované, nekomparativní, otevřené studie u pacientů s lokálně potvrzeným metastatickým NSCLC pozitivním na mutaci BRAF v600e.
požadavky na vzorky
přijatelnými vzorky pro test jsou vzorky tkáně kolorektálního karcinomu s fixací na formalinem, vložené do parafínu, s dobou fixace 6-48 hodin.
objem
preferuje se 1 reprezentativní parafinový blok. Alternativně je pro resekční vzorky vyžadováno minimálně 5 nebarvených řezů tkáně (tloušťka 5 µm) (úplné testování RAS).
pokyny pro skladování a přepravu
Udržujte a odesílejte vzorky při okolní teplotě.
omezení
nedostatečný obsah nádoru nemusí umožnit detekci mutací KRAS / NRAS / BRAF: je zapotřebí 10% nádorových buněk. Obsah nádoru se vyhodnocuje před analýzou a provede se makrodissekce. Jiné fixační prostředky než formalin nebo prodloužená doba fixace mohou vést k nedostatečným výsledkům.
zvláštní požadavky
žádné.
doba otáčení
5 až 7 pracovních dnů pro diapozitivy a parafínové bloky.
- Li et al. Vysoce ověřený test pro detekci mutace KRAS v tkáni a plazmě plic, kolorektální, a rakovina pankreatu. Arch Pathol Lab Med. 2019 únor;143:183-9
- Patten et al. Citlivý a přesný test pro současnou detekci 36 mutací BRAF a NRAS. Journal of Clinical Oncology 2018 36:15
- Douillard JY et al. Léčba panitumumabem-FOLFOX4 a mutace RAS u kolorektálního karcinomu. N Engl J Med. 2013 Září 12; 369 (11): 1023-34.
aktualizováno 03 prosinec 2019
