Úvod
biotechnologie využívá mikroorganismy i vyšší buňky a jejich aktivní principy s cílem dosáhnout žádoucí konverze různých substrátů (Tripathi et al ., 1997). L-fenylacetylkarbinol je výchozím materiálem pro chemickou syntézu hydrochloridu L-efedrinu a pseudoefedrinu farmaceutické sloučeniny používané jako dekongestant, antiastmatika (Shin a Rogers, 1995) a nedávno hlášené, používané při kontrole obezity (Astrup et al., 1992). Aromatický substrát benzaldehyd poskytne l-PAC biotransformační metodou. Některé kmeny kvasinek mají enzymy pyruvát dekaroxylázy (PDC) a alcholdehydrogenázy (ADH), které produkují L-PAC a benzylalkohol, vedlejší produkt, respektive z benzaldehydu (Nikolova a Ward, 1991). Biotransformační potenciály rostoucích buněk volně sklizené buňky imobilizované buňky a izolovaný surový i purifikovaný enzym byly Bee n rozsáhle studovány (Liew et al ., 1995; Shin and Rogers, 1996a, b).
úloha nových kmenů v biokonverzi je důležitým aspektem. Produkce L-PAC byla studována volnými a imobilizovanými buňkami saccharomyces cerevisiae za různých růstových a biotransformačních podmínek. Studovali jsme však produkci L-PAC z benzaldehydu pomocí různých nových kmenů za různých růstových a biotransformačních modalit s cílem sledovat ideální podmínky umožňující maximální výtěžek produktu při konstantní koncentraci substrátu a hustotě buněk. Produkce L-PAC je uvedena ve schématu 1.
| schéma 1: | |
materiály a metody
výroba L-fenylacetylkarbinolu s normálními buňkami Sccharomuces Cerevisiae (BY)
výroba L-Pac (klíčového meziproduktu pro mnoho léčiv) z benzaldehydu kvasinkami je potenciální cestou ve fermentačním průmyslu pro výrobu efedrinu a dalších léčiv. Tato studie byla provedena autorem v Sultan-Ul-Uloom college of Pharmacy, se sídlem v Hyderabad, Indie v roce 2004.Zásobní kultura pekařských kvasnic byla čerstvě subkulturována (Ellaiah a Krishna, 1987) na čerstvých sterilních středních sklonech YEMA a inkubována při pokojové teplotě (asi 28°C) po dobu 36 hodin. Kultura pekařských kvasnic byla sklizena třepáním v 5 mL sterilní vody. Sklizená mikrobiální suspenze byla převedena do Inokulačního média-i. složení inokulačního média je následující:
baňka byla inkubována při 28°C na rotační třepačce (180 ot / min) po dobu 24 hodin.
mikrobiální počet byl proveden pomocí Neubauerovy počítací Komory. Mikrobiální suspenze byla zředěna tak, že každý mL suspenze obsahoval 200×106 buněk. Deset mililitrů inokula z IM-I bylo přeneseno do 100 mL inokulačního média-II složení who je uvedeno níže:
baňky byly inkubovány na rotační třepačce (180 ot / min) po dobu 16 h.
bylo připraveno sto mililitrů výrobních médií. Ve většině studie bylo jako produkční médium použito melasové médium a pro srovnávací studii bylo jako produkční médium použito médium šťávy z cukrové třtiny s močovinou. Deset mililitrů inokula z IM-II bylo přeneseno do produkčního média, jehož složení je stejné jako IM-II, a inkubováno po dobu 9 hodin na rotačním třepačce. Po 9 h SE do produkčního média melasy přidá živina (20 mL 50% melasy) a živina (20 mL 50% šťávy z cukrové třtiny) se přidá do produkčního média cukrové třtiny a inkubuje se na rotačním třepačce. Od 10 h a dále 0.6% destilovaného benzaldehydu bylo přidáno v 6 rozdělených dávkách půlhodinových intervalů do výrobního média.
pak byly baňky inkubovány na rotační třepačce po dobu 24 hodin. baňky obsahující 130 mL vývaru (tj. 100 mL produkčního média+10 mL inokula+20 mL živného média) byly ošetřeny 130 mL benzenu (rozpouštědla) a protřepávány po dobu l5 minut v oddělovacích nálevkách. Poté byla organická vrstva oddělena a filtrována přes absorpční bavlnu. Nakonec byl destilován rozpouštědlový benzen, aby se získal produkt L-PAC.
výroba L-fenylacetylkarbinolu s novými izoláty kvasinek:
postupy pro Biokonverzi:
ve srovnávacích studiích byly nové kultury použity k odhadu a porovnání jejich biotransformačního potenciálu s pekařskými kvasinkami. Zásobní kultury Candida pseudointermedia MTCC č. 6225, Candida pseudountermedia MTCC č. 6352 a Issatchenkia orientalis MTCC č. 6351 byly subkulturovány asepticky na Strilových šikmých plochách YEMA se sterilizovanou přenosovou smyčkou ve sterilní oblasti (laminární proudění vzduchu).
dříve zmíněný postup (Ellaiah a Krišna, 1987) byl opakován i pro román kmeny. Ve většině studie bylo jako produkční médium použito melasové médium a pro srovnávací studii bylo použito medium šťávy z cukrové třtiny s močovinou (Kaur a Kocher, 2002).
výsledky a diskuse
L-Fenylacetylkarbinol je kapalina žluté barvy. Udávaná měrná hmotnost je 0,93 při pokojové teplotě. L-PAC produkovaný izoláty včetně pekařských kvasinek (s. cerevisia) vykazoval stejnou měrnou hodnotu hmotnosti. hodnota pH L-PAC (poměr 1: 1 vzorku l-PAC a vody) se uvádí jako 3,84. V těchto experimentech produkt L-PAC získaný biotransformací čtyřmi různými kvasinkami, jako jsou pekařské kvasinky, Candida pseudointermedia( 6225), Candida pseudointermedia (6352) a issatchenkia orientials (6351), vykazoval stejné hodnoty pH. Rf hodnota L-PAC byla hlášena (Groger a Erge, 1965) v chloroformu jako mobilní fáze na silikagelu jodové páry byly použity pro detekci skvrn.
při vývoji chromatogramů byl chloroform jako přední rozpouštědlo srovnáván se směsí rozpouštědel (30% ethylacetátu 70% hexanu) jako mobilní fáze. Pozdější fronta rozpouštědla vykazovala lepší separaci než chloroform. Takže jsme použili 30% ethylacetátu a 70% hexanu jako rozpouštědlo ve všech našich experimentech.
L-PAC je reaktivní v UV světle, jodových parách a β-Methoxynaftalenu. Hodnota Rf standardního L-PAC je kolem 0,33. Produkt L-PAC různých izolátů vykazoval stejnou hodnotu Rf.
methylketon přítomný v L-PAC podléhá Idoformní reakci (Smith a Hendlin, 1954). Zpočátku prochází halogenací a štěpením v přítomnosti alkalických látek, jako je NaOH, za vzniku Idoformy. Tato reakce je velmi specifická pro L-PAC a nevyskytuje se u vedlejších produktů. L-PAC produkovaný různými izoláty dal vznik Idoformu.
polarimetrickými a kolorimetrickými odhady byla procentuální biokonverze odhadnuta u různých izolátů kvasinek. Benzylalkohol, kyselina benzoová a nekonvertovaný benzaldehyd byly testovány vysoce výkonnou kapalinovou chromatografií (HPLC) a plynovou chromatografií (GC). Chemická struktura L-PAC byla identifikována a přizpůsobena 1H NMR a UV spektrálním datům.
několik pracovníků (Ellaiah a Krishna, 1987) provedlo fermentaci v melasě jako výrobním médiu, kromě toho v průmyslu používá melasové médium pro biokonverzní reakci při výrobě L-PAC.
v tomto šetření jsme vyzkoušeli šťávu z cukrové třtiny jako produkční médium při výrobě L-PAC. Jako produkční médium byla použita šťáva z cukrové třtiny s 0,25% močovinou, která poskytla více produktu L-PAC než melasa. Kromě toho byla extrakce produktu z prostředí šťávy z cukrové třtiny velmi výhodná než z média melasy. % Biokonverze získaná s různými izoláty kvasinek je uvedena v tabulce 1.
biotransformační potenciál volných buněk pekařských kvasinek (s. cerevisiae) byl studován jak v melasě, tak ve šťávě z cukrové třtiny jako produkčním médiu. V melasovém médiu bylo pozorováno 25% biokonverze, kde stejně jako v prostředí šťávy z cukrové třtiny bylo pozorováno 28% biokonverze.
| Tabulka 1: | přeměna melasy a šťávy z cukrové třtiny jako produkčního média při výrobě L-PAC |
biotransformační potenciál volných buněk Candida pseudointermedia MTCC č. 6225 byl studován jak v melasě, tak ve šťávě z cukrové třtiny jako produkčním médiu. U melasy bylo pozorováno 23,43% biokonverze, kde stejně jako u šťávy z cukrové třtiny bylo pozorováno 23,75% biokonverze.
biotransformační potenciál volných buněk Candida pseudointermedia MTCC No. 6352 byl studován jak v melasě, tak ve šťávě z cukrové třtiny jako produkční médium. U melasy byla pozorována 33,47% biokonverze, kde stejně jako u šťávy z cukrové třtiny bylo pozorováno 48,76% biokonverze.
biotransformační potenciál volných buněk ISSATCHENKIA orientalis MTCC č. 6351 byl studován jak v melasě, tak ve šťávě z cukrové třtiny jako produkčním médiu. U melasy bylo pozorováno 37,16% biokonverze, kde stejně jako u šťávy z cukrové třtiny bylo pozorováno 60,61% biokonverze.
závěr
na závěr byl zkoumán současný postup pro použití nových kmenů kvasinek z přírodních zdrojů pro biotransformační studie a použit pro biokonverzi benzaldehydu na L-PAC. Tři kmeny byly izolovány z různých přírodních zdrojů, jako jsou černé hrozny, Datlové ovoce a šťáva z cukrové třtiny a byly identifikovány na Institutu mikrobiální technologie, Chandigarh. Tyto tři kmeny byly označeny jako Candida pseudointermedia MTCC č. 6225 (BGY), Issatchenkia orientials MTCC č. 6351 (DY), Candida pseudointermedia MTCC č. 6352 (SCY).Což bude důležitý doplněk k současným stávajícím postupům. Nejvýznamnějším zjištěním tohoto výzkumu je použití 3 nových kmenů kvasinek pro výrobu L-PAC a použití šťávy z cukrové třtiny jako produkčního média pro výrobu L-PAC. V obou pokusech jsme úspěšní a při použití šťávy z cukrové třtiny jako produkčního média dochází ke značnému zvýšení procentuálního výtěžku L-L-PAC. Ačkoli šťáva z cukrové třtiny je ve srovnání s melasou drahá, ukázalo se, že postup extrakce je mnohem jednodušší u šťávy z cukrové třtiny ve srovnání s melasou. Další způsoby výzkumu, jako jsou různé faktory, imobilizační studie, mutační studie atd., by mohlo pomoci při stanovení nákladově efektivních metod pro výrobu L-PAC použitím šťávy z cukrové třtiny jako produkčního média. Toto je první zpráva o použití Candida pseudointermedia a Issatchenkia orientalis pro biokonverze studií benzaldehydu na L-PAC. Použití šťávy z cukrové třtiny jako produkčního média v biotransformačních studiích benzaldehydu na L-PAC je také první zprávou svého druhu. Šťáva z cukrové třtiny navíc vykazovala zvýšený potenciál biokonverze než melasové médium. Nové kmeny můžeme prozkoumat pro různé chemické reakce. Další studie v tomto směru probíhají.
poděkování
autoři jsou vděční společnosti IMTECH, Chandigarh za identifikaci nových kmenů a přiřazení čísel MTCC.
