ved hjælp af DBE-teknikken indsamlede vi systematisk biopsier fra hele den menneskelige tarmkanal og karakteriserede fordelingen af enteroendokrine k-og L-celler og ekspressionen af deres hormonelle produkter hos raske individer og personer med type 2-diabetes.
da type 2-diabetes indebærer overvægt/fedme og dysfunktionel glukosehomeostase, der kunne korrelere med ændringer i de enteroendokrine k-og L-celler, blev undersøgelsen designet til at beskrive fordelingsmønsteret for disse celler og ekspressionen af nogle af deres produkter i de to prospektivt rekrutterede, lignende størrelse, veldefinerede og matchede grupper af frivillige uden nogen kendte gastrointestinale lidelser. Ved hjælp af DBE var det muligt at opnå et stort antal prøver i hele tarmkanalen: fra ni anatomisk specifikke regioner (Fig. 1) og 7-22 ‘stationer’ langs jejunum og ileum. Biopsierne fra de anatomisk veldefinerede områder var meget sammenlignelige. Der er større usikkerhed med hensyn til biopsiplaceringer i jejunum og proksimal ileum (biopsiplaceringer 3-9, Fig. 1) på grund af den variable længde af intubation og dermed antallet af prøver opnået mellem individer. For at håndtere dette problem delte vi systematisk jejunum og ileum i syv regioner (se metoder). Det submukosale blækmærke placeret ved maksimal indsættelsesdybde under anterograd enteroskopi blev set under retrograd enteroskopi hos fire ud af 24 individer, hvilket indikerer total enteroskopi (Fig. 2). Det antages, at størstedelen af tarmkanalen blev undersøgt i resten af deltagerne som bedømt efter længden af den opnåede intubation (for detaljer, se vores metodepapir ).
vi brugte immunhistokemi og celletælling til at kvantificere de enteroendokrine celler og prohormonforarbejdningssymboler og mRNA-ekspressionsanalyse til at evaluere de hormonelle produkter. Begge metoder er veletablerede, men udgør også begrænsninger. En høj specificitet af antistoffer anvendt i immunhistokemi er af stor betydning for at sikre et minimum af uspecifik farvning (falske positiver). Derfor valgte vi antistoffer, der er veletablerede og velkarakteriserede . Ved hjælp af immunhistokemi og celletal fra mikrofotografier af skivede biopsier evalueres tredimensionelle objekter (dvs.enteroendokrine celler) med en todimensionel billeddannelsesteknik. En mere optimal teknik til evaluering af cellefordeling ville være stereologi, hvor den sande tæthed (dvs .celler/mm3 væv) estimeres. Imidlertid ville denne teknik kræve komplette tværgående ‘blokke’ af væv, hvilket er uforeneligt med det høje antal biopsisteder og dermed detaljeret kortlægning af tarmkanalen hos levende mennesker, der var rettet mod i denne undersøgelse. Desuden bør følgende tages i betragtning. For det første indikerer evaluering af mRNA-ekspression aktiviteten af endokrine celler, men giver ikke et mål for den samlede produktion af et bestemt celleprodukt, da ikke alt mRNA oversættes til et endeligt aktivt produkt. For det andet er ekspression relativ, da de specifikke mRNA-transkripter er relateret til ekspressionen af et stabilt udtrykt gen (se ESM-metoder for yderligere detaljer). I betragtning af den biologiske heterogenitet af type 2-diabetes kunne mere markante forskelle potentielt være blevet påvist med en større prøvestørrelse og inkludering af patienter med mere omfattende glukosedysregulering.Fra 1983 om fordelingen af enteroendokrine celler er det hidtil mest detaljerede udført i menneskets tarm ved hjælp af IHS med en bred vifte af antisera (25 typer) mod kendte eller foreslåede tarmneurohormonale peptider . Minimalt invasive teknikker var ikke tilgængelige på det tidspunkt. Følgelig blev prøver hentet fra kun syv regioner: proksimal og distal tolvfingertarm, mid-jejunum, distal ileum, stigende kolon, distal del af tværgående kolon eller sigmoid kolon og rektum. For hver region blev vævsmateriale opnået fra 9-17 individer. Prøverne blev hentet enten under abdominal kirurgi (primært udført på grund af malignitet) eller under enteroskopiske undersøgelser, der involverede biopsier hos personer med ‘andre gastrointestinale lidelser’, herunder en række uspecificerede symptomer og sygdomme (f.eks. ‘okkult blødning’ og ‘leversygdom’). I 1985 Adrian et al brugte en radioimmunoassay teknik til at bestemme mængden af PYY i gastrisk fundus og antrum, tolvfingertarm, jejunum, ileum, stigende kolon, sigmoid kolon og endetarm . Prøver fra hvert sted blev opnået fra 5-8 personer, der gennemgik operation på grund af karcinom eller mavesår. I 1992 blev en undersøgelse, der undersøgte fordelingen af enteroendokrine l-celler hos mennesker, rapporteret af Eissele et al . Prøver blev opnået fra syv regioner: duodenum, proksimal og distal jejunum, ileum, stigende tyktarm, tværgående tyktarm og endetarm. Prøverne blev opnået fra kun fem deltagere, der gennemgik operation for karcinom eller Crohns sygdom. I 2005 undersøgte Guedes et al fordelingen af henholdsvis GIP-, GLP-1 – og CgA-positive celler ved hjælp af IHS på prøver fra hver 20 cm af tyndtarmen i 30 humane kadavere .
det skal understreges, at de fire ovennævnte undersøgelser undersøgte normale vævsprøver uden tegn på patologiske forandringer. Tilstedeværelsen af maligne eller inflammatoriske ændringer i tarmområdet eller den hurtige påbegyndelse af celleforringelse post mortem kunne imidlertid have påvirket den generelle enteroendokrine cellefordeling og-funktion. Desuden kan deltagernes heterogenitet have påvirket resultaterne.
i overensstemmelse med vores resultater beskrev Sj Larslund et al, eissele et al, Adrian et al og Guedes et al, henholdsvis variation i L-celleprodukter (GLP-1 og/eller PYY) afhængigt af tarmlokalisering med en højere densitet/mængde i det distale jejunum og ileum sammenlignet med tolvfingertarmen og proksimal jejunum og en stigende tæthed/mængde fra proksimal til distal kolon med de højeste niveauer i endetarmen . Vores resultater understøtter dette l-cellefordelingsmønster hos raske individer og I type 2-diabetes med stigende GCG-og PYY-genekspression samt stigende tæthed af GLP-1 og PYY-positive celler langs tyndtarmen og langs tyktarmen. Vi observerede også det største signal af L-cellemarkører (PYY – og GLP-1-positive celler og PYY mRNA-ekspression) i endetarmen, bortset fra ekspressionen af GCG. Implikationerne – hvis nogen—af de observerede forskelle mellem grupper (signifikant større GCG og PYY-ekspression i tyktarmen hos deltagere med type 2-diabetes sammenlignet med raske individer) er i øjeblikket ukendt. Det er veletableret, at inkretineffekten er reduceret i type 2-diabetes, og det er blevet foreslået, at en defekt i næringsinduceret GLP-1-sekretion kan bidrage til at forklare dette fænomen. Undersøgelser, der undersøger GLP-1-reaktioner på næringsstimuli hos dem med type 2-diabetes og ikke-diabetiske individer, har imidlertid vist, at personer med type 2-diabetes generelt ikke udviser reduceret plasma total GLP-1-respons .
vi observerede en uoverensstemmelse mellem GCG-ekspressionsniveauer og densitet af GLP-1-positive celler langs tarmen. Dette understreger, at l-celler i en del af tyndtarmen kan opføre sig anderledes end enteroendokrine l-celler i en anden del af tyndtarmen, som foreslået af Svendsen et al., der observerede, at sekretionsmønsteret for L-celler ændrer sig langs mave-tarmkanalen hos rotter, dvs. at L-celler udskiller forskellige forhold mellem PYY og GLP-1, hvor nogle kun udskiller GLP-1. I tråd med disse fund er det sandsynligt, at mere distalt lokaliserede l-celler udtrykker proglucagon i højere grad end mere proksimalt lokaliserede l-celler.
vores resultater af større GIP-ekspression og densitet af GIP-positive celler i den proksimale del af tyndtarmen, begge faldende distalt til ileocaecal region hos raske individer og dem med type 2-diabetes, er i tråd med tidligere fund . I modsætning til SJ Larslund et al, der fandt, at GIP-positive celler var fraværende i tyktarmen, var vi i stand til at detektere lave niveauer af GIP-positive celler i den distale del af tarmkanalen. Vi kan dog ikke udelukke, at dette er et resultat af uspecifik antistofbinding. Imidlertid observerede vi mRNA-ekspression af GIP i tyktarmen i begge grupper, omend på meget lave niveauer. Udtrykket af GIP var signifikant større hos personer med type 2-diabetes langs hele tarmkanalen. Det kunne spekuleres i, at transkriptionen af GIP øges som et kompenserende resultat af GIP-resistens, dvs .den reducerede insulinotrope virkning af GIP observeret hos personer med type 2-diabetes. I tråd med dette har fastende GIP-niveauer vist sig at være højere hos deltagere med type 2-diabetes sammenlignet med ikke-diabetiske kontroldeltagere, og det er desuden blevet foreslået , at GIP bidrager til hyperglykæmi set ved type 2-diabetes (primært på grund af den glukagonotrope virkning af GIP) . Imidlertid, data vedrørende GIP-respons efter oral glukose eller blandede måltider hos personer med type 2 diabetes har været inkonsekvent, og en systematisk gennemgang med metaanalyse har antydet, at postprandial GIP-respons er ens hos dem med type 2 diabetes og raske individer .
i betragtning af at det sure glycoprotein CgA er en komponent af cellevesikler og anses for at spille flere roller i den sekretoriske proces af endokrine produkter, anvendes den som en generel markør for enteroendokrine celler . I modsætning til Guedes et al, der observerede en konstant tæthed af CgA-positive celler langs tyndtarmen, viste vores undersøgelse et signifikant fald. Desuden observerede vi en større tæthed af CgA-positive celler i tyndtarmen hos raske individer end deltagere med type 2-diabetes. Det kan spekuleres i, at det samlede antal CgA-positive celler (enteroendokrine celler) ændres i type 2—diabetes-enten som en konsekvens af type 2-diabetisk tilstand eller måske bidrager til patogenesen af type 2-diabetes. Vi observerede et ret højt antal CgA-positive celler i endetarmen i begge grupper. For nylig viste Engelstoft et al .hos mus , at CgA hovedsageligt var lokaliseret til monoamin-udskillende enteroendokrine celler og mere tyndt til peptid-udskillende enteroendokrine celler, måske understøtter forslaget fra Sj Larslund et al, at de rektale enteroendokrine celler kunne have en primært lokal (parakrin) funktion snarere end systemisk funktion.
da PC1/3 er kendt for at behandle prohormoner, der fører til dannelse af henholdsvis GIP og GLP-1, forventede vi at finde tilstedeværelsen af PC1/3 langs hele tarmkanalen. Vi observerede henholdsvis en uoverensstemmelse, der involverede større ekspression af PCSK1/3 og lavere densiteter af PC1 / 3-positive celler i tyndtarmen hos deltagere med type 2-diabetes sammenlignet med raske deltagere. Som beskrevet ovenfor skal dette fund fortolkes med den opfattelse, at nogle enteroendokrine celler kan være meget aktive i nogle regioner og have lav aktivitet i andre regioner.
da PC2 primært er kendt for behandling af proglucagon til glukagon i pancreas-alfa-celler, var det interessant at finde mRNA-ekspression af PCSK2 og PC2-positive celler langs hele tarmkanalen. Dette kan indikere, at glukagon produceres i tarmen, som for nylig foreslået af Lund et al . I tråd med dette kunne det spekuleres i, at den større PCSK2-ekspression i tyndtarmen hos personer med type 2-diabetes fører til dannelse af overskydende glukagon, hvilket bidrager til type 2 diabetisk hyperglucagonaæmi. For yderligere at afklare dette aspekt er undersøgelser inklusive immunhistokemisk dobbeltfarvning berettiget.
afslutningsvis giver den nuværende kortlægning af fordelingen af de enteroendokrine k-og L-celler og de observerede variationer i ekspressionsniveauer af deres relaterede produkter langs den humane tarmkanal kombineret med de demonstrerede forskelle mellem deltagere med type 2-diabetes og raske individer et referencearbejde for forskere og klinikere. Kombineret med viden fra fysiologiske undersøgelser af cirkulerende tarmhormoner kan vores data være af værdi for at forstå, hvordan tarmen bidrager til at regulere glukosemetabolismen og appetitten. Identifikation af PC2 i enteroendokrine celler er interessant, fordi dette kan være i overensstemmelse med dannelsen af glukagon i den menneskelige tarm. Imidlertid er der behov for yderligere undersøgelser for at bevise denne mulighed og knytte vores fund til patofysiologien af type 2-diabetes.
