funktionel Profilevaluering af Lactobacillus fermentum TCUESC01: en ny potentiel probiotisk stamme isoleret under Kakaofermentering

abstrakt

brugen af intestinale probiotiske bakterier er meget almindelig i fødevareindustrien og har været fokus for størstedelen af forskningen på dette område. Alligevel er forskningen i ekstraintestinale mikroorganismer i de senere år steget kraftigt på grund af deres velkendte potentiale som probiotika. Således studerede vi en stamme af Lactobacillus fermentum (TCUESC01) ekstraheret fra fermenterende kakao. Først undersøgte vi virkningen af pH på væksten af denne stamme og studerede dens overlevelse under forhold, der ligner dem i den menneskelige mave-tarmkanal. L. fermentum TCUESC01 viste modstand mod tilstande, der efterligner den menneskelige mave og tarme og voksede godt mellem pH 5 og pH 7. Dernæst udsatte vi L. fermentum TCUESC01 for opbevaring ved 4 liter C i en mælkeopløsning og fandt ud af, at den overlevede godt i 28 dage. Endelig målte vi følsomheden af denne stamme for adskillige antibiotika og dens tendens til autoaggregering. L. fermentum TCUESC01 viste signifikant autoaggregering såvel som modtagelighed for størstedelen af de testede antibiotika. Samlet set understøtter vores fund den potentielle anvendelse af denne ekstraintestinale bakterie som et diætprobiotikum.

1. Introduktion

søgningen efter nye probiotika er motiveret af viden om, at hver stamme af mikroorganismer har forskellige egenskaber og kan have unikke effekter på menneskers sundhed. Historisk blev det antaget, at mælkebakterierne i probiotiske produkter skulle hentes fra mennesker på grund af værtsens specificitet . Imidlertid udviser ekstraintestinale mikroorganismer isoleret fra fermenterede laktoseholdige fødevarer eller fermenterede grøntsager også lovende probiotiske virkninger . Foreløbige beviser fra vores laboratorium indikerer, at Lactobacillus-stammer afledt af fermentering af kakao af høj kvalitet udviser probiotiske egenskaber: de reducerer histologisk skade, reducerer den systemiske koncentration af inflammatoriske cytokiner og øger serum IgA-niveauerne i en in vivo eksperimentel model af colitis . Den mulige anvendelse af disse stammer i kommercielle produkter afhænger imidlertid af en række tests anbefalet af internationale organisationer. Ifølge FN ‘ s Fødevare-og Landbrugsorganisation (FAO) og Verdenssundhedsorganisationen (hvem) bør potentielle probiotiske stammer evalueres for deres funktionelle og teknologiske egenskaber, herunder deres modstand under gastrointestinal transit og deres stabilitet under opbevaring . Derfor vurderede vi de funktionelle egenskaber og sikkerheden ved Lactobacillus fermentum-stammen TCUESC01, der blev isoleret under gæringen af kakao af høj kvalitet.

2. Materialer og metoder

2.1. Mikroorganismer og vækstbetingelser

Lactobacillus fermentum TCUESC01 stamme (tiltrædelsesnummer KU244478, GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KU244478)) blev dyrket i lactobaciller Mrs bouillon (1% pepton, 0,8% kødekstrakt, 0,4% gærekstrakt, 2% glycose, 0,5% natriumacetat, 0,2% dikaliumhydrogenphosphat, 0,02% magnesiumsulfatheptahydrat, 0.005% mangansulfattetrahydrat og 0,02% citronsyretriammoniumsalt) (HIMEDIA kur, Indien) i 18 timer ved 37 kur C og opbevaret ved -80 kur C i en 10% mælkeopløsning (Molico kur, Brasilien) indeholdende 30% glycerol.

2.2. Analyse af vækst og levedygtighed under varieret pH

Mrs bouillonopløsninger af pH 2, pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 og pH 9 blev fremstillet ved tilsætning af 1 mol·L−1 saltsyre eller 1 mol·L−1 natriumhydroksid. Før forsøget blev L. fermentum TCUESC01 dyrket i 18 timer og derefter fortyndet i en saltopløsning (0.85% natriumchlorid) til en optisk densitet (OD) på 0,3 målt ved 600 nm (OD600 = 0,3). Forsøgene blev udført i 96-brønds mikroplader (costar-kar), hvor 180-Karr af MRS ved hver pH blev inokuleret med 20-Karr af aktiv kultur eller saltvand som kontrol. Mikropladen blev inkuberet ved 37 liter C, og OD ved 600 nm blev bestemt hver time i 10 timer ved hjælp af et spektrofotometer (molekylære enheder, der er tilpasset mikropladelæser). Parallelt, prøver blev taget hver time fra hver pH, belagt på MRS agar, og inkuberet under anaerobe forhold ved 37 liter C for at teste cellelevedygtighed.

2.3. In Vitro-Tolerance over for gastrointestinale tilstande

bakterier blev dyrket ved 37 liter C natten over i 40 mL MRS-bouillon, vasket i en saltopløsning og inokuleret i 20 mL af en 10% mælkeopløsning. Mælkefermentering fik lov til at fortsætte, indtil en pH på 4,5 var nået, på hvilket tidspunkt bakterierne blev talt (cfu·mL−1) ved seriefortynding og plettering på MRS agar. Derudover blev der udført en seriefortynding i en saltopløsning (pH 2,5) med pepsin (3 g/L) efterfulgt af inkubation ved 37 liter C i 1,5 timer. Bakterier blev vasket ved to centrifugeringscyklusser (5000 liter g/10 min) og resuspension i en saltopløsning, inden de blev resuspenderet i 20 mL 1% svinegald ved pH 8,0 (Merck liter, Tyskland) og inkuberet ved 37 liter C i 45 minutter. Bakterietællingerne (cfu * mL−1) blev bestemt ved plettering af bakterieopløsningen i MRS-agar under anaerobe betingelser ved 37 liter C i 48 timer efter hver inkubationsfase.

2.4. Overlevelse under kold opbevaring i syrnet mælk

L. fermentum-stammen TCUESC01 blev dyrket i MRS-bouillon og derefter høstet ved centrifugering (5000 liter g/10 min). Bakterierne blev derefter vasket ved resuspension i en saltopløsning og igen pelleteret ved centrifugering. Kulturerne blev inokuleret i en steril opløsning af 10% fedtfri mælk, der var blevet syrnet til pH 4,5 med mælkesyre (Synth Karrus, Brasilien). Mælkeopløsningen blev nedkølet ved 4 liter C, og de kolonidannende enheder (cfu·mL-1) blev talt ved seriefortynding og plettering på MRS agar efter 0, 7, 14, 21 og 28 dage. Stammens levedygtighed blev bestemt i forhold til nulpunktet, som blev anset for at have 100% overlevelse.

2.5. Analyse af Autoaggregering

L. fermentum TCUESC01 blev dyrket i 20 mL Mrs-bouillon natten over ved 37 liter C. bakteriepelleten blev opsamlet og resuspenderet i saltopløsning til en OD på 0,3 ved 600 nm (OD600 = 0,3). Kapaciteten af L. fermentum TCUESC01 til autoaggregering blev testet ved at inkubere suspensionen ved 37 liter C, og OD blev overvåget hver time i 5 timer. procentaggregeringen () blev beregnet som følger: hvor er den indledende optiske densitet ved nulpunktet og er den optiske densitet på målingstidspunktet. De viste resultater var gennemsnittet plus / minus standardafvigelserne fra tre eksperimenter.

2.6. Antibiotika-følsomhedstest

L. fermentum TCUESC01 blev dyrket i 18 timer i MRS-bouillon ved 37 liter C og fortyndet til 0, 5 på McFarland-skalaen i en saltopløsning. Antibiotiske skiver blev anbragt på Mueller-Hinton agarplader, der derefter blev inokuleret med 100 liter af den aktive bakteriesuspension. Pladerne blev derefter inkuberet under anaerobe betingelser for 24 h ved 37 liter C. Inhiberingsområderne omkring skiverne blev målt, og bakterierne blev klassificeret som resistente (), moderat følsomhed (MS) eller modtagelige () baseret på standarderne beskrevet i tabel 1. Antibiotika-diske bruges i modtagelighed test amoxicillin (AMO, LABORCLIN®, Brasilien, 10 µg), ciprofloxacin (CIP, LABORCLIN, Brasilien, 5 µg), amikacin (AMI, CECON®, Brasilien, 30 µg), azithromycin (AZI, CECON, Brasilien, 15 µg), amoxicillin og clavulansyre (AMC, SENSIFAR®, Brasilien, 30 µg), norfloxacin (ELLER, LABORCLIN, Brasilien, 10 µg), sulfonamid (SUL, NEWPROV®, Brasilien, 300 µg), vancomycin (VAN, SENSIFAR, Brasilien, 30 µg), streptomycin (EST, LABORCLIN, Brasilien, 10 µg), erythromycin (ERI, CECON, Brasilien, 15 µg), tetracyklin (TET, SENSIFAR, Brasilien, 30 µg), imipenem (IPM, CECON, Brasilien, 10 µg), cefalotin (CFL, LABORCLIN, Brasilien, 30 µg), gentamicin (GEN, CECON, Brasilien, 10 µg), cefotaxime (CTX, SENSIFAR, Brasilien, 30 µg), cotrimoxazole (trimethoprim og sulfamethoxazol)) (SUT, SENSIFAR, Brasilien, 25 µg), chloramphenicol (BLODPROPPER, SENSIFAR, Brasilien, 30 µg), clindamycin (CLI, CECON, Brasilien, 2 µg), penicillin G (PEN10, CECON, Brasilien, 10 µg), og cefoxitin (CFO, LABORCLIN, Brasilien, 30 µg).

2.7. Statistiske analyser

beregningerne af midler og standardafvigelser, variansanalyserne, Tukeys Multiple sammenligningstest og alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af programmet GraphPad Pristir Prism 5.0. Alle grafer blev også produceret ved hjælp af GraphPad Prism 5.0-programmet.

3. Resultater

3.1. Effekt af pH på L. fermentum TCUESC01 vækst og levedygtighed

L. fermentum TCUESC01 var i stand til at vokse i medier ved pH 5, pH 6 og pH 7 (Figur 1). Vækst blev imidlertid ikke observeret uden for dette pH-interval (Figur 1).

(a)

(b)

(c)

(d)

(i)

(f)

(da)

(h)

(og)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)

Figur 1

vækst af Lactobacillus fermentum TCUESC01 i perioden fra 0 til 10 timers kulturer ved 37 liter C i forskellig pH: (a) vækst i MRS uden ændring af pH (pH 6.52); (B) vækst i MRS med pH 2; (c) vækst i MRS med pH 3; (d) vækst i MRS med pH 4; (e) vækst i MRS med pH 5; (f) vækst i MRS med pH 6; g) vækst i MRS med pH 7; h) vækst i MRS med pH 8; i) vækst i MRS med pH 9. Hvert punkt på grafikken repræsenterer gennemsnittet og standardafvigelsen fra tre eksperimenter.

3.2. Tolerance af L. fermentum TCUESC01 til gastrointestinale tilstande In Vitro

tolerancen af L. fermentum TCUESC01 til gastrointestinal passage blev evalueret under betingelser designet til at efterligne den humane mave-tarmkanal (figur 2). En bakterieopløsning blev dyrket til en koncentration på 8,7 liter 108 cfu·mL−1 i en 10% mælkeopløsning. Efter at have underkastet bakterierne en opløsning indeholdende pepsin ved pH 2,5 i 1,5 timer for at simulere mavesaft, observerede vi en statistisk signifikant reduktion () af bakteriekoncentrationen til 1,23 liter 108 cfu·mL−1. Efter vask med saltvand blev bakterierne derefter udsat for en opløsning af 1% svinegald ved pH 8,0 i 45 minutter for at simulere tarmmiljøet. Efter denne behandling observerede vi en reduktion på ca.1 log i bakterietallet (3,6 liter 107 cfu·mL−1). Reduktionen i bakterietællinger under inkubation i simuleret tarmsaft var ikke statistisk ubetydelig.

figur 2

overlevelse af Lactobacillus fermentum TCUESC01 under passage gennem den simulerede mave-tarmkanal. “Fermenteret mælk “efter fermentering af mælken;” simuleret mavesaft “efter passage i saltvand pH 2,5 + pepsin;” simuleret tarmsaft ” efter passage i oksegald 1%. Hvert punkt på grafen repræsenterer gennemsnittet og standardafvigelsen af tre eksperimenter. Statistisk signifikant reduktion () i forhold til “fermenteret mælk.”

3.3. Overlevelse af L. fermentum TCUESC01 under Kommercielle opbevaringsbetingelser

for at evaluere deres overlevelse under opbevaring blev L. fermentum-bakterier nedkølet ved 4 kg C i 28 dage i en ellers steril 10% fedtfri mælk syrnet til pH 4,5 med mælkesyre (figur 3). Bakteriestammen var oprindeligt i en koncentration på 3,6 liter 109 cfu * mL-1, men efter 7 dages opbevaring observerede vi en statistisk signifikant reduktion på ca.1 log i bakterietallet. Fra dag 7 til dag 21 var der uventet vækst fra 4,3 liter 108 CFU·mL−1 til 9,0 liter 108 CFU·mL−1. Ved Dag 28 var bakteriekoncentrationen faldet til 2,83 liter 108 CFU·mL−1.

figur 3

overlevelse af Lactobacillus fermentum TCUESC01 i fermenteret mælk fra 0 til 28 dage ved 4 liter C. Hvert punkt repræsenterer gennemsnittet og standardafvigelsen for tre eksperimenter. “a”: statistisk signifikant forskel i forhold til dag nul (); “b”: statistisk signifikant forskel i forhold til dag 14;”c”: statistisk signifikant forskel i forhold til dag 21.

3.4. Autoaggregering af L. fermentum TCUESC01

bakterierne aggregeres i stigende grad indtil den femte time af in vitro-kultur, på hvilket tidspunkt der blev observeret maksimalt 70,19 liter 1,78% aggregering (figur 4). Imidlertid var timestigningerne i procentaggregeringen kun statistisk signifikante indtil den tredje time af eksperimentet ().

figur 4

procentdel af autoaggregering af Lactobacillus fermentum TCUESC01 evalueret fra 1 .til 5. timers dyrkning i MRS-bouillon ved 37 liter C. “a”: statistisk signifikant forskel i forhold til 1. timers aggregering; “b”: statistisk signifikant forskel i forhold til 2. timers aggregering,. Hvert punkt repræsenterer gennemsnittet og standardafvigelsen af 3 eksperimenter.

3.5. Følsomhed af L. fermentum TCUESC01 over for antibiotika

denne stamme af L. fermentum showed susceptibility to the majority of antibiotics tested (Table 2). The few exceptions were the fluoroquinolones norfloxacin and ciprofloxacin, the nucleic acid synthesis inhibitors sulfonamide and cotrimoxazole (sulfamethoxazole and trimethoprim), the cell wall synthesis inhibiting glycopeptide antibiotic vancomycin, and the cell wall synthesis inhibiting β-lactam cefoxitin. L. fermentum TCUESC01 var modtagelig for amoksicillin, amoksicillin og clavulansyre, penicillin G, cefalotin, aminoglycosider amikacin og gentamycin, lincosamid clindamycin, carbapenem imipenem, macrolider og erythromycin, phenicolchloramphenicol og tetracyclin. Stammen var også moderat modtagelig for streptomycin.

4. Diskussion

retningslinjer fastlagt af FAO, og som bekræfter behovet for at analysere bakteriens funktionelle egenskaber og sikkerhed, inden de foreslår dets anvendelse i en fødevarematrice . Vi vurderede oprindeligt kapaciteten hos denne art af Lactobacillus til at vokse og overleve ved forskellig pH, og selvom den kun udviste vækst i området fra pH 5 til pH 7, forblev den levedygtig under 10-h inkubationer på alle evaluerede pH-niveauer, med undtagelse af pH 2. Undersøgelser har vist stor variation i gastrisk pH , når maven er tom, med gennemsnitsværdier lavere end pH 4 . Tarmmiljøet er mere stabilt og varierer mellem pH 6 og pH 8 afhængigt af den evaluerede tarmregion . Selvom denne mælkesyrebakterie ikke har vist evnen til at formere sig eller overleve under pH 2,5, forbliver den derfor levedygtig i tarmens pH-område og kan derfor muligvis fungere i dette miljø. I overensstemmelse med vores data viste Lactobacillus plantarum (st194b, ST414B og ST664B), Lactobacillus rhamnosus (ST461B, ST462B) og Lactobacillus paracasei (ST242B, ST284B) isoleret fra en almindeligt forbrugt fermenteret drik fra Balkanhalvøen gode vækstrater under 10 h inkubation mellem pH 5 og pH 7 . L plantarum 423 isoleret fra sorghum drikke, L. plantarum 241 isoleret fra svin ileum, L. curvatus DF38 isoleret fra salami og Lactococcus lactis ssp. lactis HV219 isoleret fra humane vaginale sekretioner viste også vækst mellem pH 5 og pH 6,5 i lignende eksperimenter . Samlet set viser vores resultater, at L. fermentum TCUESC01 har vækst og pH-resistens svarende til andre potentielle ekstraintestinale probiotiske bakterier. Endvidere kan stammens følsomhed over for pH-niveauer lavere end 2,5 overvindes ved anvendelse af metoder, der beskytter bakterierne, såsom mikroindkapsling . Vores resultater understøtter den potentielle anvendelse af denne stamme som et probiotisk tilsætningsstof i fødevarer med tydeligt sure egenskaber, for eksempel oste, juice og fermenteret mælk.

det gastrointestinale miljø kan være fjendtligt for mange bakterier; en række stressfaktorer såsom surhed, fordøjelsessymer og galdesalte kan have negativ indflydelse på deres overlevelse under transit til tarmen . Lactobacillus i denne undersøgelse viste en diskret kvantitativ reduktion, men forblev levedygtig under mave-og tarmbetingelser og modstod en koncentration af galde tre gange, der findes i den menneskelige tarm (0,3%) . Svarende til vores data, Kaushik et al. observeret, at Lactobacillus plantarum Lp9 faldt med omkring 0,5 log fra sin oprindelige koncentration, når de udsættes for tilstande, der efterligner maven (pH 2) og 1 log, når de udsættes for tilstande, der efterligner tarmen. I en anden undersøgelse, L. rhamnosus VT1 / 1 isoleret fra ost viste en reduktion på ca .2 loginkoncentration under lave pH-betingelser (pH 3) og en reduktion på 1 loginkoncentration, når den inkuberes ved pH 7 i nærvær af 2% galdesalte. Vores resultater antyder, at L. fermentum kunne bevæge sig gennem mave−tarmsystemet og overleve i koncentrationer over 107 CFU·g−1 (eller CFU·mL-1), som tidligere undersøgelser antyder ville være tilstrækkelige til at interagere og/eller forstyrre værtsmiljøet .

fødevarematricen er også en påvirkningsfaktor i mikroorganismernes levedygtighed under deres opbevaring . Ved test af den langsigtede overlevelse af L. fermentum TCUESC01 i syrnet mælk observerede vi en indledende reduktion af bakterietællingerne efterfulgt af en lille stigning fra dag 7 til dag 21. Denne vækst kan forklares ved fortsat bakteriel metabolisme i mælkeopløsningen, dog med en reduceret hastighed på grund af den lave temperatur. Donkor et al. også observeret kvantitativ variation i probiotiske bakterier under opbevaring ved 4 liter C, især Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Lb1466, der udviste vækst af 1 log fra dag 7 til dag 14 af køleopbevaring. I en anden undersøgelse, L. plantarum opbevaret i fermenteret mælk reducerede signifikant sin cellulære koncentration med 1 log i løbet af cirka 28 dages opbevaring ved 4 kg C . Selvom L. fermentum havde udvist et fald på 1 log fra sin oprindelige koncentration inden den sidste lagringsdag, var dens koncentration over gennemsnittet på udløbsdatoen for mælkeopløsningen . På samme måde, baseret på anbefalingerne fra Det nationale agentur for sanitær overvågning (ANVISA), L. fermentum TCUESC01 kunne indføres i fødevarematricer svarende til fermenteret mælk og overleve i tilstrækkelige koncentrationer indtil produktets udløbsdato .

mikroorganismer med evnen til at autoaggregere forbliver i tarmene i længere tid og har således bedre interaktioner med epitelceller og værtsimmunsystemet . L. fermentum TCUESC01-stammen demonstrerede en forhøjet kapacitet til autoaggregering i vores 5-h-forsøg. Dette resultat er højere end det, der er rapporteret af Beganovi Larsen et al. , der demonstrerede, at L. fermentum A8 havde 60,9 liter 3.91% autoaggregation efter 5 timers inkubation, eller som rapporteret af Bao et al. , der demonstrerede autoaggregering på mindre end 28% for 10 stammer af L. fermentum efter en 20-h inkubation. Baseret på vores resultater aggregerer L. fermentum godt, og hvis det indtages, vil det sandsynligvis være i stand til at fortsætte i det menneskelige tarmmiljø i lange perioder.

endelig vurderede vi følsomheden af TCUESC01 til en række antibiotika. Kendskab til antibiotisk modtagelighed er ekstremt vigtig, når vi overvejer tre vigtige faktorer: den sjældne mulighed for infektion med Lactobacillus, risikoen for vandret overførsel af resistensgener til native mikrober og sammenhængen mellem probiotiske bakterier og antibiotikabehandling. L. fermentum TCUESC01 udviste følsomhed over for størstedelen af antibiotika med undtagelse af nukleinsyresyntesehæmmere (vancomycin og cefoksin) og to cellevægssyntesehæmmere (vancomycin og cefoksin). Disse resultater bekræfter data, der er offentliggjort af Kirgisistan et al. på 74 stammer af Lactobacillus ssp. isoleret fra menneskelig afføring, hvoraf 94.5% stammer var resistente over for amikacin, alle var resistente over for kanamycin og ciprofloksacin, 84,7% af stammerne var resistente over for vancomycin, 1,6% stammer var resistente over for cefalotin, og 8,5% af stammerne var resistente over for bacitracin. Generelt viser lactobaciller iboende resistens over for kinoloner, trimethoprim, sulfonamider, vancomycin og størstedelen af nukleinsyrehæmmere, mens de viser modtagelighed for proteinsyntesehæmmere med undtagelse af aminoglycosider . Det er værd at bemærke, at resistensen mod antibiotika, der observeres her, er iboende for slægten, som det fremgår af offentliggjorte undersøgelser, og vandret genoverførsel er derfor usædvanlig. Sammenfattende understøtter resistensprofilen af L. fermentum TCUESC01 muligheden for anvendelse sammen med antibiotika, der virker ved at hæmme nukleinsyresyntese.

5. Konklusioner

på trods af at det er en ekstraintestinal stamme isoleret under kakaofermentering, viser L. fermentum TCUESC01 et stærkt potentiale som probiotikum til anvendelse i fødevarer. Det forbliver levedygtigt på tværs af et bredt pH-spektrum og er derfor egnet til optagelse i forskellige typer fødevarer. Når det opbevares i et kølet mælkeprodukt, opretholder det levedygtighed over de niveauer, der anbefales af anerkendte nationale og internationale organisationer indtil produktets udløbsdato. Under forhold, der efterligner gastrointestinal transit, overlever den også i mængder, der er tilstrækkelige til opretholdelse af probiotisk potentiale. Med hensyn til dets forudsagte adfærd i tarmene viser L. fermentum TCUESC01 en stærk tendens til autoaggregering. Endelig udviser denne stamme antibiotisk modtagelighed og resistensprofiler, der giver mulighed for dets anvendelse sammen med lægemiddelterapier. Samlet set antyder disse egenskaber, at L. fermentum TCUESC01 har et stort potentiale som et sikkert probiotisk fødevaretilsætningsstof.

interessekonflikter

forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

anerkendelser

denne forskning blev støttet af et tilskud fra Funda Amparo en peskisa do Estado da Bahia (fapesb). Den Conselho de Desenvolvimento cient Larsfico e Tecnol Larsfico (CNP) og coordina Larso de aperfei Larsoamento De personnels de niveau superior (capes) forudsat produktivitet og Graduate stipendier for nogle forfattere.