Total RNA blev ekstraheret ved hjælp af Tripure-Isolationsreagens (Roche).
RNA-prøver blev behandlet med Rnasefri DNaseI og oprenset ved hjælp af Rneasy Mini Kit (CHIAGEN). Det resulterende RNA blev udtømt af ribosomalt RNA ved anvendelse af Ribo-nul rRNA-Fjernelsessæt (Human/mus/rotte) (Epicenter). Det rRNA-udtømte RNA blev brugt til at syntetisere den første streng cDNA ved hjælp af SuperScript kurr III First-streng Synthesis System (Invitrogen) i henhold til producentens instruktioner. Derefter blev den anden streng genereret ved anvendelse af E. coli DNA ligase (Invitrogen), E. coli-DNA-polymerase (Invitrogen) og dUTP, dctp, dATP og dGTP-sæt (10 liter hver, Promega) i den anden Strengbuffer (Invitrogen). Derefter blev cDNA skåret med Covaris til cirka 300 BP. Efter fragmentering blev prøver oprenset med MinElute-søjler (Chiagen). Og de fremspringende 3′ og 5′ ender af fragmenterne blev repareret ved hjælp af T4 DNA-Polymerase (NEB) og T4 DNA-Polynukleotidkinase (NEB) i T4 DNA-ligasebuffer (NEB). Derefter blev da-ender genereret ved at anvende Kleno-Fragment (3′ ->5′ ekso -, NEB), i Buffer 2 (NEB). Adapterligationsreaktioner blev derefter oprettet ved hjælp af indekserede adaptere og hurtig Ligase (NEB). Produkterne blev anvendt som skabelon til UNG (Fermentas) behandling og PCR-amplifikation ved anvendelse af Phusion high-Fidelity DNA Polymerase (NEB). Bibliotekerne blev visualiseret på 2% E-Gel-agarosegeler til generelle formål (Invitrogen). De stregkodede biblioteker blev sekventeret på en enkelt bane af en Hisek2500 (Illumina).
