High Fidelity& effektiv PCR: kod DNA polymerase
den hypertermofile archaea Thermococcus kodakaraensis KOD1 (tidligere Pyrococcus kodakaraensis KOD1) (Fig. 1) blev isoleret fra en solfatarisk varm kilde (Fig. 2) på Kodakara island (Fig. 3) i Japan, og blev identificeret og karakteriseret.
en familie B DNA-polymerase (KOD DNA-polymerase) blev fundet i denne KOD1-stamme og viser forskellige unikke egenskaber (1).
-
Fig. 1. Thermococcus kodakaraensis KOD1
-
Fig. 2. Indtjekning udtjekning vis priser Solfatara)
-
Fig. 3. Udforsk lignende hoteller Kodakara island)
KOD DNA-polymerase udviser stærk 3′ ll-5 ‘ eksonukleaseaktivitet (korrekturlæsningsaktivitet), en aktivitet, som tak DNA-polymerase mangler.
desuden udviser dette en fremragende processivitet og forlængelsesevne, der viser en fem gange højere forlængelseshastighed (100-130 nukleotider/sekund) og 10-15 gange højere processivitet (>300 baser) end den fra Pyrococcus furiosus (Pfu DNA-polymerase). 2 gange højere end for tak DNA-polymerase (tabel 1)(Fig. 4) (1).
tabel 1. Egenskaber af termostabile DNA-polymeraser
| Proterty | værdi for indikeret DNA-polymerase | ||
|---|---|---|---|
| KOD DNA polymerase | PFU DNA polymerase | Tak DNA polymerase | |
| Oprindelse | Archaea | Archaea | bakterier |
| udledt molekylvægt (kDa) | 90.0 | 90.1 | 93.9 |
| optimal temperatur) | 75 | 75 | 75 |
| optimal pH ved 75 liter | 6.5 | 6.5 | 8.0-8.5 |
| termostabilitet (halveringstid) | 95 liter,12 timer; 100 oC,3,0 timer | 95 liter, 6 timer; 100 liter, 2,9 liter | 95 liter, 1.6h |
| 5’→3′ exonuclease activity | – | – | – |
| 3’→5′ exonuclease activity | + | + | – |
| Terminal transferase activity | – | – | – |
| Processivity (bases) | >300 | <20 | ND |
| Elongation rate (bases/s) | 106-138 | 25 | 61 |
Fig. 4. Sammenligning af forlængelseshastigheder for KOD Pfu og tak DNA-polymerase.
forlængelseshastigheden blev målt i henhold til længden af syntetiseret DNA ved anvendelse af M13 ssDNA som skabelon ved 75 liter.
parallelt med undersøgelsen af aktiviteterne af KOD DNA-polymerase blev neutraliseringsantistoffer til polymerasen og korrekturlæsningsaktiviteterne udviklet (2). Disse antistoffer kan påføres “hot start PCR-teknologien” ved anvendelse af KOD DNA-polymerase.
3-D-strukturen af DNA-polymerase blev karakteriseret i 2003 (Fig. 5) (3).
Fig. 5. 3-D struktur af KOD DNA-polymerase
J. Mol. Biol., 306: 469-477 (2001)
KOD-Plus – (kode nr. KOD-201) blev udviklet baseret på KOD DNA-polymerase og udviser høj PCR-troskab (Tabel2).
tabel 2. Sammenligning af mutationsfrekvensen for hver PCR.
| samlede baser sekventeret | Antal muterede baser | Mutationsfrekvens (10-5) | |
|---|---|---|---|
| KOD-Plus- | 145,753 | 5 | 3.4 |
| KOD | 144,535 | 19 | 13.1 |
| PFU DNA polymerase | 113,080 | 12 | 10.6 |
| PCR-PCR | 167,343 | 218 | 130.3 |
| DNA-polymerase | 102,708 | 145 | 141.2 |
Fidelity blev målt som mutationsfrekvensen ved sekventering af PCR-produktet. Efter kloning af PCR-produktet (2,4 kb af den humane beta-globin-region) blev omkring 96 kloner valgt og sekventeret.
kodenummer. 101) blev udviklet baseret på Kod DNA-polymerase og viser en meget større PCR-succesrate (baseret på effektivitet og forlængelsesfunktioner) end KOD – Plus – (kode nr. KOD-201) eller andre PCR-baserede enheder. KOD er også effektiv til amplifikation fra råprøver (f.eks.
Fig. 6. Direkte forstærkning fra en rå musehale lysat
1,2: KOD valuta
3~6: andet selskabs værdier
M: markører
