2.3.4.1 strukturen
apo-sCTLA-4-homodimer blev udtrykt som et thrombin-spalteligt Fc-fusionsprotein i CHO-celler i nærvær af kifunensin.23 Efter deglycosylering gav homodimer krystaller, der diffrakterede til Bragg-mellemrum på 1,8 liter, med enhedscelledimensioner på a = 43,86 liter, b = 51,46 liter og c = 102,85 liter og rumgruppen P212121 (Ref. 130). Strukturen blev løst ved molekylær udskiftning. Den asymmetriske enhed omfattede en disulfidbundet homodimer, der muliggør sammenligninger med sctla-4/sB7-1 og sCTLA-4 / sB7-2 komplekser og med sCTLA-4 bundet til en konstrueret lipocalin.131
de to monomerer i den asymmetriske enhed bestod af domæner med agfcc’ og ABED topologi.132 en kort otte-rest “stilk” disulfid-bundet ved Cys122 bundet igsf-domænerne til membranen. Uventet lignede de to halvdele af APO-CTLA-4 homodimer mindre hinanden end deres komplekse modstykker, idet de understregede, at binding ikke ledsages af store strukturelle omlejringer (Fig. 2.2 H). Automatiserede struktursammenligninger identificerede CD28 og PD-1 som de strukturer, der mest ligner CTLA-4. Vigtige forskelle mellem CTLA-4 og CD28 var: i) tilstedeværelsen af et knæk i cd28-streng G, ii) ændringer i sløjfestørrelse inklusive udvidede AB -, BC-og CC-sløjfer i CTLA-4 og en trunkeret C”D-sløjfe og iii) h-binding af C” og C” – strenge som følge af omplacering af C’ C ” – sløjfen i CD28. Af afgørende betydning var den stort set identiske konformation af FG loop 99MYPPPY104-sekvensen, der danner kernen i deres ligandbindende overflader. Kun et enkelt vandmolekyle kunne findes i den usædvanligt tørre ligandbindende overflade af apo-CTLA-4, mens 228 farvande blev påvist andetsteds.
efter CD28 og PD-1 var de næstmest lignende strukturer til CTLA-4 V-sæt domæne 215 antistof-eller TCR V-domæner, der hovedsagelig kun adskiller sig i sløjfelængder. R. m.s.-forskellen for superposition af CTLA-4 med det mest lignende TCR Va-domæne var 2,09 liter for 102 rester, i modsætning til 2,89 liter for 86 rester for superposition med D1 af CD2. Vigtige delte funktioner med Va-domænet omfattede den lange CC ‘loop og konserverede Kristian-buler i C’ og G-Kristian-strengene, der indførte en udtalt vri på AGFCC’ Kristian-sheet. Særligt bemærkelsesværdigt var den høje grad af sekvensbevarelse og Ca-konformation nær G-streng-bulgen, det vil sige GNGTKIYV (CTLA-4) og GDGTKVV (Va). I CD2 og CTLA-4 var sløjferne ens, og domænerne var forskellige for så vidt som: (i) i CD2 der var ingen H-binding af ßA og ßB strands, (ii) der var ingen twist af EN’GFCC’ β-sheet i CD2 på grund af forskydning af β-buler, (iii) placeringen af C” β-strand i CD2, men ikke CTLA-4 lov kanonisk T-limning og udvidelse af AGFCC’C” β-sheet, og (iv) CTLA-4 manglede twist i den FG løkke til stede i CD2 (og også, fx, B7-1). Analysen af tooghalvtreds V-sæt IgSF-domæner ved anvendelse af et sekventielt strukturjusteringsprogram 133 indikerede, at CD28/CTLA-4-familien omfatter en undergruppe af V-sæt domæner, der adskiller sig fra grupperingerne af CD8, antigenreceptorer og “adhæsionsmolekyler”, for eksempel B7-1 og CD2. Samlet set var der større lighed mellem CD28 / CTLA-4-undergruppen og antigenreceptorfamilien sammenlignet med adhæsionssættet. Analysen antydede, at CD28/CTLA-4-familieproteiner og antigenreceptorer delte en fælles forfader, der muligvis lignede PD-1, hvor de to familier divergerede tidligt.
Apo-CTLA-4 omfattede en homodimer med dens underenheder, der vedtog et arrangement, der favoriserede ortogonale bivalente interaktioner med ligander placeret på apposerende celleoverflader. Sammenligninger med CTLA-4 monomerpar i B7-1 og B7-2 komplekserne 106,107 og monomeren i lipocalin-komplekset131 afslørede meget begrænset rotationsfleksibilitet ved homodimer-grænsefladen og bemærkelsesværdigt få, hvis nogen, ændringer, der kan henføres til ligandbinding. De eneste forskelle var tydelige i B7-2-komplekset med let omplacering af BC-og CC’ – sløjferne og af C” prisT-streng og tilstødende sløjfer og konformationelle forskelle i G-prisT-streng ved dens C-terminal. Disse lokale variationer var fjernt fra ligandbindingsstedet for CTLA-4, og apo-monomerer adskiller sig under ingen omstændigheder systematisk fra alle fem komplekse CTLA-4-monomerer. Hovedkædeatompositionerne i 99mypppy104-sekvensen var i det væsentlige identiske.
strukturerne af komplekserne dannet af CTLA-4 med B7-1 og B7-2, som ikke tidligere var blevet sammenlignet, var helt forskellige.130 Substitution i B7-2, af Val28 vs Arg29 i B7-1, dannede en bindende lomme i B7-2, der kun delvist blev udfyldt af CTLA-4. Dette sikrede, at B7-1/CTLA-4-komplekset udviste bedre formkomplementaritet end B7-2 / CTLA-4-komplekset. Kompenserende lidt for dette var overfladearealet begravet i B7-2 af CTLA-4 noget større end for B7-1. Samlet set B7-1 bundet CTLA-4 på en endnu mere stiv kropslignende måde end CTLA-4 engageret B7-1. B7-2 binding af CTLA-4 var, imidlertid, mere kompleks og bar kendetegnende for “induceret pasform.”I CTLA – 4 bound-vs apo-B7–2, var der en 2,3-3,5 liter skift af B7-2 FG loop mod CTLA-4, der blev initieret af en ~ 120 grader rotation af Phe31 af B7-2 (Ref. 130). Dette producerede en stabling interaktion af Phe31 med Pro102 af 99mypppy104 sekvens af CTLA-4.
