Kluyveromyces Udvikler ethanoltolerance under adaptiv udvikling med signifikante forbedringer af flere veje

forbedret modstandsdygtighed over for ethanol efter en 100-dages udvikling

vildtype haploid K. stammen blev dyrket i medium med 6% (v/v) ethanol ved 30 kg C i 100 dage omkring 450 generationer (se metoder for detaljer). Der var en kontinuerlig stigning i biomasse (målt ved OD600 dagligt) i denne periode (Fig. 1a), hvilket indikerer celleoverlevelse under ethanolspænding kan forbedres. I slutningen opnåede vi en K. marksianus-population med stærkt forbedret modstandsdygtighed over for ethanol (Fig. 1b). KM refererer til den rå stamme før evolutionen, og KM – 100d henviser til K. marcianus befolkning efter 100-dages evolution. Den maksimale ethanolresistens for KM var 7% (v/v) og for KM-100d var den op til 10% (Fig. 1b). Vi sammenlignede vækstprofiler mellem KM og KM-100D i kulturmedier med forskellige ethanolniveauer (0%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% v / V, Fig. 1c). I fravær af ethanol var der ingen signifikant forskel mellem stammerne. Deres forskel steg med stigningen i ethanolniveau og nåede det maksimale med 6% (v/v) ethanol i kulturmedier. Under sådanne omstændigheder var biomassen på KM-100d efter 48 h næsten dobbelt højere end KM. Begge stammer viste forsinket vækst i medium med 7% ethanol og kunne ikke vokse i mediet med 8% ethanol. Derudover viste KM-100d også bemærkelsesværdig højere maksimal vækstrate end KM ved 6% ethanol (yderligere fil 1: Figur S1).

K. evolution i 6% (v/v) ethanol. en daglig OD600 værdi af K. marksianus befolkning under evolution. Celler blev hver dag overført og subkultureret til et frisk medium indeholdende 6% (v/v) ethanol med den samme initiale OD600 på 0,6. Derefter blev OD600 målt efter inkubation ved 30 liter C i en orbitalryster i 24 timer for at registrere cellevækst. B Spotted fortyndingsanalyse for ethanoltolerance mellem præ – og post-evolution. Km og KM-100D celler blev inokuleret på flydende medium med ethanol i en af gradientkoncentrationerne: 0, 1, 2,…, 11% (v / v) henholdsvis og inkuberet ved 30 liter C i 3 dage. En cellesuspension på 10 OD600 fra det flydende medium blev 5 gange serielt fortyndet og plettet på en YPD-plade og dyrket ved 30 liter C i 2 dage. C Vækstprofiler på KM og KM-100d ved forskellige ethanolkoncentrationer. Den røde kurve er for KM-100D, og den sorte er for KM. Under måling af vækstprofil blev KM og KM-100D begge udført i biologisk tre eksemplarer

DNA-analyse antyder, at K. marksianus ikke har nogen ændring af ploidi eller kritiske gener under adaptiv evolution

for at belyse DNA-ændringer i KM-100d gennemførte vi DNA-ploidianalyse og DNA-mutationsidentifikation. Under den adaptive udvikling har DNA-indholdet af K. marksianus-befolkningen ringe ændring (yderligere fil 1: Figur S2); således fandt ingen ploidyændring sted. Ved DNA-sekv-analyse af KM og KM-100d , som begge blev kortlagt til referencegenomet af K. marksianus DMKU 3-1042, blev SNP-stederne mellem KM og KM-100d opnået (yderligere fil 2). Blandt de identificerede 57 SNP ‘ er var kun 4 steder dominerende i km-100D befolkning. Tre af dem er placeret i kodningsregionen SAN1, YAP1 og KHT2 gener; den anden er ved 445 bp opstrøms for ERG26. 1324-stedet for SAN1 blev muteret fra C til T, og følgelig blev den tilsvarende aminosyre transformeret fra arginin til cystein. Ifølge analysen af Pfam 32.0, falder denne mutation ikke ind i noget identificeret proteindomæne. Både mutationerne i YAP1 og KHT2 er synonyme mutationer uden proteinændring. Ovenstående fund antyder, at ændringer i DNA-kontekst langt fra er tilstrækkelige til at understøtte en sådan fænotypeforbedring I KM-100D, og transkriptionel omprogrammering skal bidrage til dette. Derfor gennemførte vi yderligere RNA-sekv-analyse.

en global ledningsføring induceret af 100-dages evolution

for grundigt at forstå ethanoltolerancen udførte vi en RNA-sekv-analyse for at sammenligne genekspressioner af KM og KM-100d gær, der voksede i medier med 4% og 6% (v/v) ethanol. Baseret på vækstprofilerne (Fig. 1C), blev det observeret, at vækstevnen mellem KM-100D og KM havde den maksimale forskel ved 48 h; derfor blev prøver ved 48 h indsamlet til RNA-sekv-analyse. Indstilling / log2ratio / ret 1 og p værdi < 0.05 som kriterium for at definere signifikante differentielt udtrykte (de) gener udførte vi de-genidentifikation i syv grupper (Fig. 2, betegnet som 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). I hver gruppe blev de-analysen udført i henhold til pilen, der pegede på kontrollen. Yderligere fil 3 giver ekspressionsværdier og differentiel ekspressionsstatistik for alle gener. Der er en global ekspressionsforskel mellem KM og KM-100d, når de begge voksede i et ethanolfrit medium (Fig. 2 gruppe①). KM – 100d gær har 1342 gener med højere ekspression end KM-gæren, mens kun 188 gener har lavere ekspression. I medier med 4% og 6% (v/v) ethanol reduceres antallet af opregulerede gener i KM-100d kraftigt til henholdsvis 415 (gruppe②) og 453 (gruppe③). Imidlertid er de opregulerede gennumre stadig meget mere end dem med lavere ekspression (henholdsvis 104 og 182 gener). Disse resultater tyder på, at KM-100d gær er transkriptionelt kablet ved at aktivere et stort antal gener. Forslaget blev yderligere understøttet af de ethanolinducerede ekspressionsændringer inden for KM og KM-100d gær. Under induktion af 4% og 6% (v/v) ethanol har KM-gæren 1452 og 1465 opregulerede gener (grupperne Einstein og L. A.), mens KM-100d-gæren kun har henholdsvis 631 og 596 opregulerede gener (grupperne0). Derudover anvendte vi heatmap.2 programmer i R-pakke til klyngegener og grupper baseret på log2ratio-værdier (yderligere fil 1: Figur S3) og fundet gendifferentialekspressionsprofilen i gruppe ① er tæt på den for gruppe helminthicide. Samlet set opretholdt KM-100d gær mange ethanolinducerede ekspressionsfunktioner, selvom de voksede i et ethanolfrit medium. Funktionerne gør, at den udviklede celle er mere adaptiv til kommende ethanolstimulering, dvs.KM-100d gær behøver ikke aktivere så mange gener som KM Gør.

Global analyse af RNA-sek-data I KM og KM-100d under ethanolspænding. I denne figur opdelte vi RNA-sekv-data til gendifferentialekspressionsanalyse. KM og KM – 100D blev præsenteret i henholdsvis venstre og højre del, og ethanolkoncentrationer 0%, 4% og 6% (v/v) var placeret i rækker. RNA-sek-data blev inddelt i syv grupper, betegnet som①,②,③,①, Nvidias, Lentis og Vasilias. I hver gruppe peger en pil på kontrollen til identifikation af differentiel ekspression, og de røde cifre angiver det opregulerede gennummer, mens de grønne repræsenterer det nedregulerede nummer

derefter udførte vi i hver gruppe gen ontologi (GO) berigelsesanalyse for de gener (yderligere fil 1: Figur S4), og fandt ud af, at de berigede go-termer dækkede en bred vifte af cellulære basale fysiologiske processer, herunder ribosombiogenese, aminosyre biosyntese, DNA-reparation, RNA-behandling osv., men ikke direkte relevant for ethanolresistens. Derfor fokuserede vi i det følgende især på veje, der er stærkt forbundet med ethanolmetabolisme og tolerance, ved at analysere de tilknyttede de-gener (yderligere fil 4).

KM-100d forbedret ethanolforbrug

for at lette grafillustration blev log2ratio-værdierne for involverede de-gener (yderligere fil 4) opdelt i fem intervaller: 1 ~ 2, 2 ~ 3, 3 ~ 4, 4 ~ 5, 5 ~ 6 (ovenfor), som vist i Fig. 3.

mulige ethanolforbrugsruter i K. marksianus. I denne figur forbruges ethanol både i cytoplasmaet (den øverste del) og mitokondrier (den nederste del). Blågrå rektangel betegner det involverede gen, og grupper①,②,③,③, Benjaminit, olitog bit er i overensstemmelse med disse definitioner i Fig. 2. Rød og grøn i gruppe nummer angiver gens op-og nedregulering, henholdsvis. Farveintensitet repræsenterer graden af genekspressionsændring, korrespondancen mellem farve og log2ratio-værdi kvantificeres af farvelinjen i figurens øverste venstre hjørne

forskellen mellem KM og KM – 100d i ethanolforbrug blev undersøgt. Som illustreret i Fig. 3, kan der findes to ruter til direkte forbrug af ethanol og blev begge opreguleret I KM og KM-100d, når de står over for ethanol (grupper santidi, allitogvili). En måde er via cytoplasmatisk ADH6, som katalyserer ethanol til acetaldehyd, lettet af NADP+. Den anden er ved mitokondrie atf1, som fremmer ethanolesterificering ved hjælp af acetyl-CoA. Især i KM-100d under ethanolstress (grupper②) blev YGL039V opreguleret for at generere mere NADP+ og kan således levere flere coensymer til omdannelse af ethanol til acetaldehyd for at reducere ethanoltoksicitet. I mitokondrier blev kun C2E1P301 og ADH4 opreguleret For KM eksponeret i ethanolspænding (grupper hel og K). Mens I KM-100d, under processen fra ethanol til aldehyd til acetat, blev C2E1P301, ALD4, ADH3, ADH4 og ALD6 alle opreguleret (gruppe①). De ovennævnte ændringer indikerer, at KM-100d kan erhverve ny evne til at lindre ethanoltoksicitet ved at øge ethanolforbruget. Teorien forklarer, at KM-100d udførte over KM i medium med ethanol.

KM-100d forbedret membranlipidbiosyntese, anti-osmotisk tryk, antioksidativ stress og proteinfoldning for at modstå ethanolspænding

udover at blive forbrugt påvirker den akkumulerede ethanol direkte cellemembranintegriteten, ændrer det indre og ydre osmotiske tryk, forstyrrer proteinkonformation og inducerer reaktiv iltart (ROS) generation og derved forårsager alvorlig skade på gærcelle . I det følgende analyserede vi de gener i disse veje for anti-ethanol-forårsagede skader i K. marksianus (Fig. 4).

et skematisk diagram for anti-ethanol forårsagede skade i K. marksianus. I den venstre del af denne figur pålægger akkumuleret ethanol i mediet et osmotisk tryk på gærcellen og aktiverer derefter den osmotiske responsive vej. I den midterste del trænger miljøethanol ind i cellen og forstyrrer cellemembranen. I den højre del syntetiseres cellemembranlipider for at befæste og reparere den beskadigede cellemembran. I den nedre del forstyrrer ethanol proteinkonformation og forårsager oksidativ stress, således aktiveres de relaterede sensorer og responsveje. Gruppetallene og farverne for genets differentielle ekspression er på linje med dem i Fig. 3

efter ethanoldrevet udvikling blev alkoholspændingsresponsvejen I KM-100d aktiveret. ASR1 , som translokerer fra cytoplasmaet til kernen ved eksponering for ethanol, og ETP1 , der fungerer som et cytoplasmatisk retentionsprotein med en rolle i ethanolafhængig transkriptionel aktivering af varmechokproteingener, blev begge opreguleret I KM-100d (gruppe①) og delvist opreguleret I KM står over for ethanol (grupperne AA og KS), hvilket antyder, at selv i et ethanolfrit medium kan KM-100d forberede responsive veje til ethanoludfordring, ligesom KM ‘ s reaktion på ethanol.

dannelsen af membranlipid spiller en vigtig rolle i at holde cellemembranintegritet under ethanolspænding . Umættede fedtsyrer, nøglekomponenterne i cellemembranstrukturen, er tæt forbundet med ethanoltolerance . Illustreret i Fig. 4, fra acetyl-CoA til umættet fedtsyrebiosyntese til inkorporering i phospholipid, blev de involverede gener PPT2, FAD2 og TAS1 alle opreguleret I KM-100d (gruppe①), hvilket antyder, at KM-100d efter evolution allerede kan forbedre umættet fedtsyrebiosyntese for at levere flere råmaterialer til cellemembranbiogenese. Og nedreguleringen af generne ACC1, TSC13, FAS1 I KM eksponeret i ethanol (grupperne Einstein og B. A.) er i overensstemmelse med den tidligere rapport , som kan redegøre for K. marksianus’ svage ethanoltolerance før adaptiv udvikling.

et stort antal gener associeret med cellemembranlipidbiogenese, herunder phosphoglycerid, sphingolipid og sterol, blev differentielt udtrykt under ethanolspænding (Fig. 4). Især gener involveret i phosphoglycerid biosyntese blev generelt opreguleret I KM-100d (gruppe①) og I km-faced ethanol (grupperne AA og B), hvilket indikerer, at phosphoglycerid kan være den vigtigste komponent i cellemembranen for ethanolresistens. Til sterolbiosyntese blev mange gener (f.eks. ERG9 og ERG7) nedreguleret i grupper ② og Einstein, og flere gener blev opreguleret i gruppe utiliti(f. eks. ERG25) og gruppe Hiti (f. eks. ERG26), hvilket tyder på, at sterolbiogenese kan være vigtig for at stå op til høj ethanol, men ikke for lav ethanol. Derudover blev gener CKI1, ERG2 og ERG25, der var involveret i phosphoglycerid-og sterolbiosyntese, kun opreguleret i gruppe nvidi; dette kan være et af ledetrådene For KM-100d ‘ s bedre ydeevne end KM i høj ethanol.

høj ethanolkoncentration i et medium pålægger osmotisk stress på gærceller . Som vist i Fig. 4 blev plasmamembranens osmotiske sensorer (SLN1, OPY2 og SHO1) og gener (HOG1, SSK1 og SSK2) involveret i den nedstrøms responsive vej alle opreguleret I KM eksponeret i lav ethanol (gruppe EFT) og individuelt opreguleret I KM-100d (Gruppe①), I KM-100d står over for ethanol (grupper santit og allit), og I KM konfronteret med høj ethanol (gruppe erit). Glycerolproduktion er en vigtig måde for S. cerevisiae modstå osmotisk tryk . Når KM og KM – 100d stod over for ethanol, blev de fleste gener relateret til glycerolbiogenese nedreguleret. Ovenstående resultater tyder på, at før og efter evolution, K. imidlertid, dens strategi for at modstå osmotisk stress er muligvis ikke afhængig af glycerolproduktionsruten, der skal eksistere nogle andre måder.

cellevæg giver tilstrækkelig mekanisk styrke til , at cellen kan modstå osmotisk tryk, og den sekretoriske vej transporterer ikke kun cellevægsproteiner udad, men overfører også lipider til plasmamembran for at befæste membranstrukturen; derfor kan disse to processer være ansvarlige for anti-osmotisk stress. Vi analyserede de gener i den sekretoriske vej og cellevægsbiogenese (yderligere fil 1: Figur S5). Gener involveret i den sekretoriske vej og cellevægsbiogenese blev generelt opreguleret I KM-100d (gruppe①), og nogle af dem blev også opreguleret I KM eksponeret i ethanol (grupperne 3 og B). Det indebærer, at KM-100D ikke kun opretholdt opreguleringen i sekretorisk vej For KM resistent over for ethanolspænding, men også bredt udvidet aktiveringsomfanget af sekretorisk vej for at forberede sig på ethanolangreb; derfor kan forbedring af sekretorisk vej og cellevægsdannelse være den nye strategi KM-100d udviklet til at udholde ethanolforårsaget osmotisk stress. På den anden side, for KM og KM-100d eksponeret i lav ethanol (grupper②), mange gener i den sekretoriske vej var begge nedreguleret, hvilket antyder, at sekretorisk vejaktivering muligvis ikke er den nødvendige måde for K. marksianus reagerer på lav ethanol.

For mod iltningsspændingen udløst af ethanol (Fig. 4), HYR1 , der fungerer som en sensor og transducer af hydroperilte stress, blev opreguleret I KM og KM-100d begge eksponeret i høj ethanol (grupper nvidiand Bulgaria). Skn7 og STB5 blev opreguleret I KM-100d (gruppe①) og I KM stod over for høj ethanol (gruppe mm). MTM1 og PRK1) blev generelt opreguleret I KM-100d, enten eksponeret i ethanol eller ej (grupper①, santid og Nintendos). For thioredoksinsystemet er gener (f. eks., MKR1 og TRR1) blev opreguleret I KM og KM-100d begge står ethanol. Thioredoksin og dets reduktase blev også rapporteret at øge tolerancen over for flere lignocelluloseafledte hæmmere . For glutaredoksinsystemet blev generne GRKS2 og GLR1 kun opreguleret I KM-100d eksponeret i høj ethanol (gruppe nvidi). For peroksombiogenese blev gener som PEKS6 og PEKS7 opreguleret I KM-100d (gruppe①), og nogle andre gener (f.eks. Ovenstående indebærer, at KM – 100d globalt kan styrke antioksideringsevnen.

for at sikre korrekt proteinfoldning under ethanolspænding (Fig. 4) blev varmechoktranskriptionsfaktoren HSF1 opreguleret I KM og KM-100d står over for lav ethanol (grupper Cylon og Einstein), et antal chaperonrelaterede gener (f.eks. PFD1 og CPR7) blev opreguleret I km-konfronteret ethanol (grupperne einsteinsolit og mm), holdt også op-regulering i KM-100d (gruppe①). CPR4) nedreguleret I km står ethanol blev ikke nedreguleret I KM-100d. Derfor kan KM-100d generelt forbedre proteinfoldning for at give et mere stabilt cellulært miljø.

det blev rapporteret, at trehaloseakkumulering i S. cerevisiae var vigtig for ethanoltolerance på grund af, at trehalose fungerede som kompatibelt opløst stof for at forhindre tilstrømning af overskydende salte til gærceller ; i mellemtiden blev gener involveret i trehalosedbrydning også induceret af ethanol for at justere det ved den optimale koncentration . For K. Markus (Fig. 4), fandt vi, at gener, der deltager i trehalose biosyntese og nedbrydning (f. eks., NTH1 og TSL1) blev almindeligvis opreguleret, når de blev behandlet med lav ethanol (grupperne ① og EFT), men ikke gen opreguleret i trehalosemetabolisme, når de blev udsat i høj ethanol (grupperne nvidi og Bulgaria). Dette tyder på, at trehaloseakkumulering i K. marksianus kan være en særlig strategi til håndtering af lav ethanol, men ikke for høj ethanol.

differentialekspressionerne af 15 gener involveret i de ovennævnte ethanoltolerante veje blev valideret med RT-kpcr-analyse (Fig. 5). Geners udtryk i gruppe ① (Fig. 5a) var generelt opreguleret. På den anden side er opreguleringen af gener i gruppe ① (Fig. 5D) og gruppe (fig. 5e) var ikke så høj som i gruppe {(Fig. 5B) og gruppe mm (Fig. 5c). Vores analyse bekræftede, at gener, der bidrager til ethanoltolerance, kontinuerligt aktiveres i KM-100d, selv efter tilbagetrækning af ethanolspænding. Den kontinuerlige genekspression kan være nyttig til at stabilisere det intracellulære miljø og gavne væksten af celler i kommende stress.

RT-kpcr-analyse for gendifferentiel ekspression af KM og KM-100d i forskellige grupper. en KM-100d vs. KM begge i det ethanolfrie medium. Dette er til DE genanalyse i gruppe①. B KM eksponeret i 4% (v/v) ethanol vs. KM i et ethanolfrit medium. Dette er for gruppe {. C KM eksponeret i 6% (v/v) ethanol vs. KM i et ethanolfrit medium. Dette gælder for gruppe K. d KM-100d eksponeret i 4% (v/v) ethanol vs. KM-100d i et ethanolfrit medium. Dette er for gruppe. e KM-100d eksponeret i 6% (v/v) ethanol vs. KM-100d i et ethanolfrit medium. Dette er for gruppe individual. I hver prøve blev 18S brugt som en intern kontrol. Total RNA blev isoleret fra celler dyrket ved 48 timer i biologisk triplicat

validering af forbedret ethanolforbrug og modstandsdygtighed over for flere spændinger i KM-100d

vi kontrollerede væksten af KM og KM-100d gær i YNB-medium med forskellige kulstofkilder (Fig. 6a). Både km og KM-100d gær har samme evne til at udnytte glukose som den eneste kulstofkilde. I nærværelse af 1% og 2% (v/v) ethanol som den eneste kulstofkilde voksede KM-100d gær imidlertid bedre end KM gær. Resultatet understøtter vores førnævnte hypotese om, at KM-100d gær udnyttede ethanol mere effektivt end KM gær gjorde.

cellevækstanalyse på ethanol og cellelevedygtighed og fermentering under flere belastninger. en Cellevækstanalyse af KM og KM-100d baseret på glukose eller ethanol som kulstofkilde. En cellesuspension på 10 OD600 blev femdoblet serielt fortyndet og plettet på en YNB-plade med glukose eller ethanol som den eneste kulstofkilde og dyrket i 2 dage, som illustreret langs søjler. B-celle levedygtighedsanalyse af KM og KM-100d under termisk stress. Temperaturerne er 30 C, 37 C, 40 C og 45 C C celle levedygtighed assay under oksidativ stress. H2O2 blev brugt som iltning stimulus, og dens koncentrationer er 0%, 0,04%, 0,06% og 0,08%. d cellelevedygtighed under osmotisk tryk. Højt salt (NaCl) blev brugt til at forårsage osmotisk tryk med koncentrationer på 0 M, 0,5 M, 0,6 M og 0.7 M. E Ethanoludbytte og glukoseudnyttelse I KM og KM-100d under de grundlæggende omstændigheder. f Ethanoludbytte og glukoseudnyttelse under 45 g C. g Ethanoludbytte og glukoseudnyttelse under 6% (v/v) ethanolspænding. h Ethanol udbytte og glucose udnyttelse under 8% (v/v) ethanol stress. I underfigur b–d Er KM og KM-100D henholdsvis i den første og anden række. En cellesuspension på 10 OD600 blev 5 gange serielt fortyndet og plettet på en YPD-plade og dyrket i 2 dage. Bortset fra den termiske test med specificerede temperaturer, andre test blev alle udført ved 30 liter C. I underfigur e-h repræsenterer henholdsvis venstre y-akse og højre y-akse glukoserester i mediet (betegnet med sort) og ethanolproduktion (betegnet med blåt)

på den anden side baseret på Fig. 4, KM – 100d kan udvikle resistens over for ethanol-forårsaget flere spændinger samtidigt, herunder osmotisk stress, iltningsspænding og termisk stress (for varmechokproteiner taget som chaperoner til proteinfoldning). For at evaluere gærens tolerancer for flere belastninger gennemførte vi cellens levedygtighedsassay for henholdsvis forskellige temperatur -, iltnings-og osmotiske tryk (Fig. 6b-d). I de grundlæggende omstændigheder (dvs.30 liter C, 0% H2O2 og 0 M NaCl) mangler der en forskel på levedygtighed mellem KM og KM-100d gær. I nærvær af de forskellige belastninger udviser KM-100d gær imidlertid signifikant bedre levedygtighed end KM-gærens. Endvidere er fordelene mere signifikante, mens spændingerne blev mere alvorlige (Fig. 6b-d). Vi forventede, at tolerancerne for flere belastninger kunne introducere nye funktioner til gærene i ethanolproduktion.

vi undersøgte yderligere ethanolproduktivitet mellem KM og KM-100d gær under flere belastninger. Under grundlæggende omstændigheder (30 liter C og 0% ethanol, Fig. 6e), er KM og KM-100d gær næsten ens i både glukoseforbrug og ethanolproduktion. KM-100d gær viste imidlertid betydelige fordele i nærvær af høj temperatur (45 liter C, Fig. 6F) eller mere ethanol (6% eller 8%, Fig. 6g, h) ; det fælles miljø skete normalt i det sene fermenteringsstadium. Vi gennemførte en RT-kpcr-analyse for både KM og KM-100d gær gæret i medier med 6% ethanol ved 48 h, 72 h og 120 h (Fig. 7). De fleste af disse ethanoltolerante gener blev opreguleret I KM-100d sammenlignet med I KM, især på det tidligere stadium (48 h) til indledende justering af ethanol (Fig. 7). For at opsummere, ved at opregulere udtryk for ethanoltolerante gener, overgik KM-100d gærene KM-gærene under stressende miljøer med øget ethanoludbytte.

analyse af genekspressioner I KM og KM – 100d under fermentering. en KM-100d vs. KM begge ved 48 h i gæring. b KM-100D vs. KM begge ved 72 h i gæring. c KM-100D vs. KM begge ved 120 h i gæring. I hver prøve blev 18S brugt som en intern kontrol. Både KM og KM – 100d blev dyrket i medier med 6% ethanol. Total RNA blev isoleret fra celler dyrket i biologisk triplicat