komparativ analyse af KnockOut-Lutserum med føtalt bovint Serum til In Vitro Langtidskultur af humane limbale epitelceller

abstrakt

de limbale epitelceller kan opretholdes på 3T3 føderlag med føtal bovint serum suppleret dyrkningsmedium, og disse celler er blevet brugt til med succes at behandle limbal stamcellemangel. Imidlertid, føtalt bovint serum indeholder ukendte komponenter og viser kvantitative og kvalitative parti-til-parti-variationer. For at forbedre dyrkningstilstanden blev den definerede KnockOut-serumudskiftning undersøgt for at erstatte føtal bovint serum til dyrkning af human limbal epitelcelle. Humane primære limbale epitelceller blev dyrket i henholdsvis KnockOut serum og føtal bovint serum suppleret medium. Cellevæksthastigheden, genekspression og vedligeholdelse af limbale epitelstamceller blev undersøgt og sammenlignet mellem disse to grupper. Humane primære limbale epitelceller blev isoleret og med succes dyrket serielt i dette nye KnockOut serum suppleret medium; celleproliferationen og stamcellevedligeholdelsen var den samme som for celler dyrket i føtal bovint serum suppleret medium. Disse data antyder, at dette KnockOut serum suppleret medium er en effektiv erstatning til traditionelt føtal bovint serum suppleret medium til limbal epitelcellekultur, og dette medium har et stort potentiale for langvarig vedligeholdelse af limbale epitelceller, limbal epitel stamcelletransplantation, og vævsregenerering.

1. Introduktion

hornhindeepitelstamceller er placeret i det basale lag af limbus, en bølget og pigmenteret struktur kaldet palisaderne af Vogt . Disse stamceller opretholder den kontinuerlige fornyelse af hornhindeepitelet over en levetid og erstatter sårede eller mistede hornhindeepitelceller . Limbal stamcellemangel (LSCD) og tilknyttede okulære overfladesygdomme kan behandles med succes ved hjælp af dyrket limbal epithelial autograft . Succesen med disse kirurgiske behandlinger afhænger af effektiv udvidelse af limbale epitelstamceller, der involverede 3T3 føderlag og føtal bovint serum (FBS) i de fleste tilfælde. 3T3-fødelagskultursystemet blev oprettet af Rheinvald og Green og er med succes blevet brugt til at udvide epitelceller fra menneskelig hud, hårfollikel, limbus, bindehinde og mundslimhindevæv . FBS er dog ikke veldefineret, og det viser altid kvantitative og kvalitative lot-to-lot variationer . FBS indeholder også potentielt skadelige fremmedgørende komponenter, som kan stimulere immunologiske reaktioner og overføre dyresygdomme og patogener . Med alle disse bekymringer er der et stigende behov for at udvikle veldefineret kulturmedium til erstatning for det traditionelle FBS-supplerede medium.

i øjeblikket er der visse serumfrie alternative medier til vækst af epitelceller, såsom defineret Keratinocytserumfrit Medium (Ksfm-Karr, Invitrogen, USA), keratinocytvækstmedium (KGM-Karr, Clontech, USA), Epilife-Karr (Invitrogen, USA) og Progenitorcellemålrettede (PCT) medier (CellnTEC-Karr, Sverige). Disse produkter har vist sig at understøtte udvidelsen af hornhindeepitelceller. De har dog stadig brug for kosttilskud af udefinerede produkter, såsom bovint hypofyseekstrakt (BPE) eller humant serumalbumin (HAS). Og de fleste af disse medier kræver høj cellesåningstæthed, hvilket måske ikke er praktisk til udvidelse af humane hornhindeepitelceller. Desuden kunne hornhindeepitelstamceller, der detekteres som holokloner i 3T3-kultursystemet, ikke opretholdes i dette serumfrie dyrkningsmedium på lang sigt . Til dato er der intet defineret serumfrit medium, der kan understøtte ekspansion af hornhindeepitelstamceller på lang sigt.

KnockOut-serumudskiftning (SR) er en defineret serumfri formulering, der er designet til direkte at erstatte FBS til vedligeholdelse af embryonale stamceller (ESC ‘er) og inducerede pluripotente stamceller (iPSC’ er). Det er blevet påvist, at KnockOut SR giver ensartede vækstbetingelser for ES-celle-og iPSC-Kultur, og ES-celler dyrket i KnockOut SR-suppleret medium er væsentligt mindre differentierede end dem, der dyrkes i FBS-suppleret medium, og kimlinjetransmission kompromitteres ikke mindst. I betragtning af lighederne i kulturmetoderne for epitelceller og ES-Celler og i lyset af det faktum, at KnockOut SR erstatter FBS i ES-cellekultur, her antages det, at KnockOut SR kunne bruges til at erstatte FBS i limbal epitelcellekultur.

2. Materialer og reagenser

cellekulturskåle, kolber, centrifugerør og serologiske pipetter blev købt fra Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ; http://www.bd.com/). Dulbeccos modificerede Eagle ‘s Medium (DMEM), Ham’ S F-12, HEPES, penicillin og streptomycin, L-glutamin, 0,05% trypsin-0.02% EDTA-opløsning, Superscript III-kit og rneasy Kurt-kit blev erhvervet fra Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). Fetal bovint serum (FBS) blev købt fra Hyclone (Logan, UT; http://www.hyclone.com/). Mus NIH 3T3 fibroblaster (ATCC CCL 92) blev opnået fra American Type Culture Collection (Rockville, MD; http://www.atcc.org/). Dispase II var fra Roche. Monoklonalt antistof (mAb) mod ABCG2 (klon Ae-21) Og forbindelse 43 var fra Millipore; p63 (klon 4A4), K5 og K19 kom fra Santa Cruce; K3 mAb (klon AE5) kom fra ICN Pharmaceuticals (Costa Mesa, CA; http://www.mpbio.com/). Aleksa Fluor 568-konjugeret gede anti-mus sekundært antistof var fra Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). GeneAmp RNA-PCR og Universal PCR Master blanding AMPERASE UNG kits var fra Applied Biosystems (Foster City, CA; http://www.appliedbiosystems.com/). Mitomycin C, bovint insulin, humant transferrin, hydrocortison, human epidermal vækstfaktor (EGF), koleratoksin og andre reagenser var fra Sigma-Aldrich (St. Louis; http://www.sigmaaldrich.com/).

2.1. Human Limbal Epitelcelleisolering og dyrkning

hornhinde-limbale ringe blev høstet fra fem raske donorer lige efter hornhindetransplantation, informeret samtykke blev søgt, og prøvehøstprotokollen blev godkendt af institutionel revision Board (IRB) af Jilin University. Friske hornhinde-limbale ringe blev behandlet med 0,25% Dispase II ved 4 kg C natten over, og epitellag blev skrubbet fra det underliggende stroma væv og behandlet med 0,05% trypsin-0,02% EDTA ved 37 kg C i 15 minutter. Trypsinaktiviteten blev neutraliseret med 10% FBS, og dissocierede limbale epitelceller blev opsamlet og centrifugeret ved 1.500 omdr. / min. i 5 minutter. Epitelcellelevedygtighed blev bestemt af trypanblåt eksklusive farvning, og celletal blev talt under anvendelse af hæmocytometer.

mus 3T3 fibroblaster blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Ørnemedium (DMEM, høj glukose) suppleret med 10% FBS, L-glutamin (2 mM) og penicillin-streptomycin (50 IE/mL) og dyrket med 5% CO2 og befugtet atmosfære. 3T3 celler blev subkultureret hver 6.dag, når de nåede 80-90% sammenløb. 3T3 celler blev serielt vedligeholdt, og kun celler før passage 20 blev anvendt til fremstilling af fødelag. Til fremstilling af fødelag blev sammenflydende 3T3-celler behandlet med mitomycin C (10 kg/mL) i 2 timer ved 37 kg C, vasket med PBS to gange og behandlet med 0,05% trypsin i 5 minutter ved 37 kg C. 3T3 fibroblaster blev derefter opsamlet og belagt med en densitet på 30.000 celler/cm2 en dag før såning af epitelceller.

humane limbale epitelceller blev dyrket på 3T3 feeder lag under anvendelse af enten FAD medium eller serum erstatning (SR) medium. FAD-mediet er en blanding af DMEM og Ham ‘ S F-12-medium (1 : 1), der indeholder 10% føtalt bovint serum, L-glutamin (2 mM) og penicillin-streptomycin (50 IE/mL), epidermal vækstfaktor (10 ng/mL), insulin (5 liter/mL), adenin (0,18 mM), hydrocortison (0,4 liter/mL), koleratoksin (0,1 nM) og triiodothyronin (2 nM). SR-mediet er en blanding af DMEM og Ham ‘ S F-12-medium (1 : 1) indeholdende 10% KnockOut SR-serumudskiftning, L-glutamin (2 mM) og penicillin-streptomycin (50 IE/mL), epidermal vækstfaktor (10 ng/mL), insulin (5 liter/mL), adenin (0,18 mM), hydrocortison (0.4 liter/mL), koleratoksin (0,1 nM), triiodothyronin (2 nM), transferrin (5 liter/mL) og selen (5 ng/mL). Limbale epitelceller blev podet på 3T3 feeder lag ved en densitet på 6.000 celler/cm2 og dyrket med 5% CO2 og befugtet atmosfære. FADMEDIET blev ændret hver 3.dag, mens SR-mediet blev ændret hver 2. dag.

2.2. Kolonidannende effektivitetsanalyse (CFE)

til CFE-analyse blev 200 humane limbale epitelceller fra FAD-kultur eller SR-kultur belagt på 100 mm petriskål indeholdende mitomycin C-behandlet 3T3-fødelag og dyrket som beskrevet ovenfor. Efter 12-dages kultur blev skålene fikseret med 10% formalin i 30 minutter ved stuetemperatur og farvet med 1% Rhodamin B i yderligere 30 minutter. Efter vask med destilleret vand blev kolonitallene talt og analyseret. Kolonidannelseseffektiviteten blev udtrykt som antallet af dannede kolonier divideret med 200.

2.3. Cellepopulation fordobling Assay

limbale epitelceller blev opretholdt på mitomycin C-behandlet 3T3 feeder lag under anvendelse FAD medium eller SR medium. Epitelceller blev trypsiniseret, når de nåede 80-90% sammenløb og passeret med en densitet på 6.000 celler/cm2. Kulturer blev serielt opretholdt i 10 passager. Ved hver passage blev limbale epitelceller høstet, og celletal blev talt. Antallet af befolkningsdoblinger (PD) for hver passage blev beregnet efter følgende formel: , hvor repræsenterer det samlede antal celler opnået ved hver passage og repræsenterer antallet af pletteringsceller i begyndelsen.

2.4. RNA-ekstraktion og kvantitativ Realtidspolymerasekædereaktion

for at evaluere genekspressionsniveauet for limbale epitelceller blev PCR og realtids PCR udført. Total RNA blev ekstraheret fra hornhindeepitelcellerne ved hjælp af RNeasy-kittet efter producentens anvisninger. RNA ‘ et blev kvantificeret ved dets absorption ved 260 nm og opbevaret ved -80 liter C. For at syntetisere cDNA ‘ er blev 1 liter Total RNA anvendt med Superscript III revers Transkriptionssæt. PCR blev udført under anvendelse af platin PCR master blanding (Life Technology); og realtids PCR blev udført under anvendelse af SYBR grøn PCR Master blanding (Roche) med de tidligere beskrevne primere . Realtids PCR-reaktioner blev udført i tre eksemplarer med et initialt aktiveringstrin ved 95 liter C i 3 minutter efterfulgt af 45 cyklusser: 95 liter C i 30 sekunder, 60 liter C i 30 sekunder og 72 liter C i 40 sekunder. Relativ genekspression blev beregnet ved normalisering af forskellen i cyklustærskelværdi (delta Ct), værdier af generne til delta Ct-værdien af glyceraldehyder-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH).

2.5. Immunofluorescerende farvning

humane limbale epitelceller blev podet i kulturglas med 3T3 fødelag i FAD medium eller SR medium. Tre dage efter såning blev kulturer fikseret med 4% paraformaldehyd eller kold acetone ved 4 kg C i 10 minutter. Efter vask med PBS to gange blev celler blokeret med 5% gedeserum i PBS i 30 minutter. Musens primære antistoffer mod p63 (1 : 200, 4A4, Santa Cruce), ABCG2 (1 : 30, BP-21, Millipore), K3 (1 : 400, Millipore) og conneksin 43 (1 : 1000, Millipore) blev påført og inkuberet natten over ved 4 kg C. Aleksa Fluor 568-konjugeret sekundært antistof blev påført i 1 time efter vask med PBS to gange. Cellekernerne blev derefter modfarvet med Hoechst 33342 (1 liter/mL i PBS) i 20 minutter. Efter vask med PBS i 3 gange blev cellekulturen monteret med monteringsmedium (Vektorlaboratorier, Burlingame, CA) og undersøgt under et fluorescerende mikroskop (Bh 50; Olympus, Tokyo, Japan).

2.6. Vestlige Blot analyse

dyrkede limbale epitelceller blev lyseret med RIPA buffer (10 mm Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% natrium deoksicholat, 1% Triton 100, 1 mM EDTA og proteasehæmmer cocktail; Roche Diagnostics) på is i 30 minutter. Proteinkoncentrationen blev kvantificeret ved anvendelse af bicinchoninsyre (BCA) proteinassay (Pierce, Rockford, IL). Total cellelysater (40 liter) blev elektroforeseret i 12% gradient SDS-SIDEGEL, overført til nitrocellulosemembran (Bio-Rad), blokeret med 5% skummetmælk i Tris-bufret saltvand (TBS) i 1 time og undersøgt med musantistoffer mod prolifererende cellekerneantigen (PCNA, Santa Croce, CA), ABCG2 (BKSP-21, Millipore) eller p63 (4A4, Santa Croce, CA) natten over ved 4 liter C. membranerne blev derefter vaskes tre gange med TBS, inkuberet med ged anti-mus IgG (1 : 5000, HRP-konjugeret, Santa Cruce, ca) eller kanin anti-ged IgG (1 : 5000, HRP-konjugeret, Santa Cruce, CA) i 1 time ved stuetemperatur og udviklet med forbedrede kemiluminescerende substrater (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Ekspressionsniveauerne for ABCG2, PCNA og p63 blev målt ved hjælp af semikvantitativ intensitetsmåling og normaliseret til GAPDH-niveau, der fungerede som intern kontrol.

2.7. Statistik

sammenfatning af data for CFE og relativ fold af realtids-PCR blev rapporteret som betyder, at de blev sammenlignet ved hjælp af elevens uparrede test med Microsoft (2003). Testresultater blev rapporteret som to-tailed værdier, hvor blev betragtet som statistisk signifikant.

3. Resultater

3.1. Fænotypen af Hornhindeepitelstamceller i SR-Medium

i alt 5 hornhinde-limbal ringvæv blev høstet fra donorer i aldersgruppen 32-65 år. Disse væv blev konserveret og behandlet inden for 24 timer efter høst. Human primær hornhindeepitelcellekultur blev med succes oprettet i FAD-medium (Figur 1(A) og 1(b)) og SR-medium (Figur 1(c) og 1(d)) også. Hornhindeepitelcellerne opretholdt i SR medium + 3T3 føderlag viste en morfologi med lille størrelse og højt kerne/cytoplasmaforhold, hvilket var typisk udifferentieret epitelcellemorfologi, og de store differentierende flade pladelignende celler blev sjældent observeret (Figur 1(c)). Epitelcellerne opretholdt i SR-medium begyndte at danne kolonier 3 dage efter såning (Figur 1(c)). Størrelserne af disse kolonier svarede til dem, der blev dannet inden for FAD medium + 3T3 feeder lag (Figur 1(A)), men disse kolonier var mindre tæt komprimeret end dem i FAD + 3T3 feeder lag. Inden for 7 dage nåede epitelceller sammenløb i SR-medium med ensartet lille størrelse (figur 1(d)), som også blev observeret i FAD-kultur (Figur 1(b)). I denne undersøgelse kunne humane hornhindeepitelceller udledes og opretholdes i SR medium + 3T3 feeder lag for alle fem donorer. Til langvarig dyrkning blev humane hornhindeepitelceller serielt subkultureret i SR medium + 3T3 feederlag i mere end 10 passager (). Under hver passage blev celler trypsiniseret og opsamlet, når celler nåede 80-90% sammenløb; celletal blev beregnet for populationsdoblingsanalyse. Resultatet viser, at epitelcelleudbyttet fra SR-medium er tæt på det for celler dyrket i FAD-medium, som vist i figur 2(A), og disse data ligner tidligere rapporter . Sammenfattende viser de data, der præsenteres her, at sr-kulturmedium + mitomycin C-behandlet 3T3-føderlag understøtter humane hornhindeepitelceller klonal vækst og proliferation.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figur 1

kulturen af humane limbale epitelceller i SR-medium. (a) de humane hornhindeepitelceller dannede tæt komprimerede kolonier i FAD-medium efter såning af celler i 3 dage. (b) efter 7 dage nåede epitelceller sammenløb i FADMEDIUM med ensartet lille størrelse. (C) humane hornhindeepitelceller dannede kolonier inden for SR-medium, som svarede til dem, der blev dannet inden for FAD-medium, men disse kolonier var mindre tæt komprimeret end dem i FAD. (d) efter 7 dage nåede epitelceller sammenløb i SR-medium med ensartet lille størrelse, der svarede til dem i FAD-kultur Original forstørrelse: (a) tir 10; (b) tir 10 (skalestænger: 100 tir).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

figur 2

sammenligning af cellepopulation fordobling (PD) og kolonidannende effektivitet (CFE) af humane limbale epitelceller dyrket i SR og FAD medier. (a) humane limbale epitelceller blev serielt subkultureret i SR medium og FAD medium for 10 passager (); cellepopulation fordoblinger (PD) nummer og akkumuleret PD blev beregnet og plottet. PD blev beregnet efter følgende formel:, hvor repræsenterer det samlede antal celler opnået ved hver passage og repræsenterer antallet af pletteringsceller i begyndelsen af hver passage. (b) for at analysere CFE blev limbale epitelceller podet med en densitet på 200 celler pr.100 mm petriskål i SR-og FADMEDIER og fik lov til at vokse i 12 dage. C) CFE-værdier for epitelceller i Sr og FAD-medier var henholdsvis og. Der blev ikke fundet nogen forskelle i CFE mellem SR medium og FAD medium group (, ). (D) procentdel af koloniseret område i FAD var tæt på SR-medium. De limbale epitelceller opretholdt i SR-medium udviste lignende CFE og kolonistørrelse sammenlignet med celler opretholdt i FAD-medium.

3.2. CFE-analyse

dernæst undersøgte og sammenlignede vi CFE af hornhindeepitelceller dyrket i FAD og SR medier. For at analysere CFE blev hornhindeepitelceller dyrket i SR-og FADMEDIER høstet og podet med en densitet på 200 celler pr.100 mm petriskål, som blev preseeded med mitomycin C-behandlet 3T3 feederlag, og denne kultur fik lov til at vokse i 12 dage. Hornhindeepitelcellerne begyndte at danne kolonier 5-7 dage efter kulturinitiering. Som vist i figur 2(b) udviste hornhindeepitelcellerne, der blev opretholdt i SR-medium, efter dyrkning i 12 dage lignende CFE og kolonistørrelse sammenlignet med celler, der blev opretholdt i FAD-medium. CFE-værdi for epitelceller i Sr og FAD-medier var henholdsvis og (figur 2 (c)). Statistisk analyse viste, at der ikke var nogen signifikante forskelle i kolonidannelseseffektivitet () og det gennemsnitlige areal af kolonierne () mellem SR og FAD-medier (figur 2(c)). Vi kvantificerede procentdelen af kolonityperne baseret på koloniens område. Resultaterne viste, at procentdelen af abortive kolonier (koloniområde <1 mm2) dannet i SR-medium svarede til den inden for FAD-medium (). Tilsvarende var procentdelen af store kolonier (koloniområde >4 mm2) dannet i SR-medium tæt på den i FAD-medium () (figur 2(d)). Disse resultater indikerer, at hornhindeepitelceller dyrket i SR-medium har en lignende højere grad af proliferativt potentiale sammenlignet med celler dyrket i FAD-medium.

3.3. PCR-og realtids-PCR-analyse

for at studere genekspression blev PCR og realtids-PCR udført på epitelceller dyrket i både FAD og SR-medier. Housekeeping GAPDH blev brugt som en intern kontrol. PCR-data viser, at cellen dyrket i både FAD-medium og SR-medium viser transkriptionsekspression på højt niveau af proliferativ markør PCNA. Cellerne i begge medier viser positiv ekspression af cytokeratin 3 og cytokeratin 12, hvilket er i overensstemmelse med deres limbus Oprindelse. Den positive ekspression af basallagepitelcellemarkør, cytokeratin 15, blev også observeret i begge kulturer. ABCG2-og Kursnp63-Kurp-ekspression blev påvist i begge kulturer, skønt abcg2-ekspression faldt lidt efter primær kultur i SR-medium. Det lave niveau af forbindelse 43-ekspression blev observeret i begge kulturer og antydede lavt niveau af epitelcelledifferentiering i begge medier. For realtids-PCR viste kvantitativ analyse af mRNA-niveauet, at der ikke var nogen signifikant ekspressionsforskel () på p63 og ABCG2 mellem epitelceller dyrket i FAD og SR-medier (figur 4(A)). Realtidsanalyse af hornhindeepiteldifferentieringsmarkøren cytokeratin 3 og cytokeratin 12 blev også udført. Begge disse to markører var næppe påviselige i både FAD-og SR-cellekulturer, og overraskende er der ingen signifikant forskel () i ekspressionsniveau mellem disse to kulturer.

3.4. Immunofluorescerende farvning

for at bekræfte, at epitelcellerne dyrket i SR-medium opretholdt stammen og udifferentieret tilstand, blev immunofluorescerende farvning af adskillige proliferations -, differentierings-og formodede epitelstamcellemarkører udført. Som vist i figur 4 viste de fleste epitelceller i SR-medium en lille og ensartet morfologi, og de fleste celler blev stærkt farvet med p63, den formodede epitelstamcellemarkør. ABCG2-positive farvede celler blev også observeret i en ujævn fordeling inden for de limbale epitelcellekolonier. Cellerne, der blev opretholdt i SR-medium, blev svagt farvet for forbindelse 43 og cytokeratin 3. Den lave ekspression af disse to differentieringsmarkører antyder lavt niveau af epitelcelledifferentiering i cellekulturen. Den lignende farvningsstil blev også observeret i celler opretholdt med FAD medium (figur 4(b)). Disse data indebærer, at humane limbale epitelceller dyrket i SR-medium opretholdt højt niveau ekspression af formodede epitelstamcellemarkører, mens de udtrykker lavt niveau af differentieringsmarkører.

3.5. Vestlig Blot

for at dobbeltbekræfte den kvantitative genekspression og immunofluorescerende farvningsresultater blev ekspressionen af potentielle epitelstamcellemarkører (p63 og ABCG2) og proliferationsmarkør (PCNA) evalueret ved hjælp af vestlig blot. Ved anvendelse af monoklonalt P63-antistof (klon 4A4, Santa Cruce) blev P63-proteinet (70 KD, kolon-isoform) detekteret ved højt ekspressionsniveau i SR-medium. Ekspressionen af ABCG2 (70 KD) blev påvist i hver passage af celler dyrket i SR-medium. PCNA, proliferationsmarkør, blev også påvist i celler dyrket i SR-medium (figur 3(c)). Og ekspressionsniveauerne for p63, ABCG2 og PCNA var ens i 10 passager med semikvantitativ intensitetsmåling (figur 3(d)) ved hjælp af GAPDH som intern kontrol.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

figur 3

genekspression og proteinekspression i humane limbale epitelceller. (a) genekspressionsanalyse af humane limbale epitelceller. PCR-data viser, at cellerne dyrket i både FAD medium og SR medium viser højt niveau ekspression af proliferationstranskript PCNA i P1, P4, P7 og P10. Cellerne i begge medier viser positiv ekspression af cytokeratin 3 og cytokeratin 12, hvilket indebærer deres limbus Oprindelse. Den positive ekspression af basallagepitelcellemarkør, cytokeratin 15, blev også observeret i begge kulturer. ABCG2-og Kursnp63-kurp-ekspression blev påvist i begge kulturer; deres ekspression blev observeret at være faldet lidt efter passage 7 (P7) i begge kulturmedier. Det lave niveau af forbindelse 43 (Cks43) ekspression blev observeret i begge kulturer og antydede lavt niveau af epitelcelledifferentiering i begge medier. (B) kvantitativ realtids-PCR-analyse af humane limbale epitelceller dyrket i Sr-og FAD-medier. Real-time PCR blev udført på epitelceller dyrket under anvendelse af både FAD og SR medier. Housekeeping GAPDH blev brugt som en intern kontrol. Analyse af de limbale epitelstamcellemarkører p63 og ABCG2 mRNA fandt, at der ikke var nogen signifikant forskel (,) i ekspression mellem epitelceller dyrket i FAD og SR-medier. Realtidsanalyse af hornhindeepiteldifferentieringsmarkøren cytokeratin 3 og conneksin 43 blev udført. Alle disse markører var næppe påviselige i både FAD-og SR-cellekulturer, og overraskende er der ingen signifikant forskel (,) på ekspressionsniveau mellem disse to kulturer. Alle realtids PCR-eksperimenter blev udført i tre eksemplarer. (C) vestlige blot assay af humane limbale epitelceller dyrket i FAD og SR medier. Ekspressionen af proliferationsmarkør (PCNA) og potentielle epitelstamcellemarkører (p63 og ABCG2) blev evalueret ved hjælp af vestlig blot. Ved anvendelse af monoklonal antistofklon 4A4 blev P63-proteinet (70 KD) detekteret ved højt ekspressionsniveau i SR-medium. Ekspressionen af ABCG2 blev påvist i hver passage af celler dyrket i SR-medium. PCNA, cellekerneantigenet, en celleproliferationsmarkør, blev også påvist i epitelceller dyrket i SR-medium. (D) udtrykket af ABCG2, p63 og PCNA blev kvantificeret og plottet ved hjælp af semikvantitativ intensitetsmåling. Blot tætheden af ABCG2, p63 og PCNA blev målt og normaliseret til niveauet af GAPDH.

(a)

(b)

(a)
(b)

figur 4

ekspression af epitelstamcelleproducenter og differentieringsmarkører i humane limbale epitelceller. De humane limbale epitelceller blev stærkt farvet med ABCG2 og p63 (grøn) i Sr og FAD medier. De celler, der blev opretholdt i Sr-og FAD-medier, viste svag farvning for forbindelse 43 (Cks43) og cytokeratin 3 (K3). (a) SR medium og (b) FAD medium. Oprindelig forstørrelse: (- en) Lot 10; (b) Lot 10 (skala barer: 100 lot). Undersøgelserne blev udført i tre eksemplarer, og repræsentative tal er vist her.

4. Diskussion

epitelceller dyrket på 3T3 feederlag er med succes afledt og anvendt til behandling af forskellige kliniske situationer, såsom alvorlige forbrændinger, diabetiske fodsår, huddefekter og mundslimhindedefekter . Den første transplantation af limbale epitelstamceller blev beskrevet i 1997 af Pellegrini et al. . I løbet af de sidste årtier er der udviklet flere forskellige kulturmetoder, herunder kultur af limbale epitelceller på human fostervandsmembran (skinke) med eller uden 3T3 føderlag, kultur af epitelceller på temperaturresponsive plader og kultur af epitelceller med kommercielt serumfrit dyrkningsmedium. Som nylig rapport indikerer, at det kliniske resultat af hornhinde/limbus epitelceller transplantation afhænger af, om de limbale stamceller bevares i cellekulturen, blev det påpeget, at holokloner kun blev bevaret i FAD + 3T3 kultursystem . Da denne kulturprotokol involverer brug af FBS, der er voksende sikkerhedsproblemer for, at FBS er dårligt definerede animalske produkter og har et potentiale til at overføre dyreafledte sygdomme til patienter . Derfor er der stigende behov for at udvikle animalsk produkt-fri og FBS-fri dyrkningsmedium til at erstatte traditionelle FAD medium .

i denne undersøgelse udviklede vi et nyt serumfrit kulturmedium, hvor KnockOut SR erstattede FBS. Fænotyperne af limbale epitelstamceller i dette nye serumfrie dyrkningsmedium blev evalueret ved immunfarvning med antistoffer for foreslåede stamcellemarkører (p63, ABCG2) og differentieringsmarkører (cytokeratin 3, forbindelse 43).

den nukleare transkriptionsfaktor p63 blev tidligere foreslået at være en markør for epitelstamceller, og Pristn-den dominerende isoform af p63-isoformer i disse celler . Vores resultater er i overensstemmelse med disse tidligere rapporter; nuclear p63 blev stærkt udtrykt i limbal cellekultur, som blev vist ved immunfarvning, realtids PCR og vestlig blot. Tilstedeværelsen af p63 i limbalcellekultur indikerer deres høje proliferative og selvfornyelsespotentiale. ABCG2, et medlem af ATP bindende kassette (ABC) transportører, oprindeligt kendt som brystkræftresistent protein 1 (BCRP1), er blevet foreslået som en anden formodet stamcellemarkør for voksne stamceller, herunder limbus epitelstamceller . Den høje ekspression af ABCG2 i SR-mediet blev påvist ved immunfarvning og realtids-PCR.

K3 og K12 er velkendte som hornhindespecifikke markører . Konsekvent viste vores immunfarvning og realtids PCR-resultater, at cellerne var K3 og K12 negative, hvilket bekræftede deres limbus-Oprindelse. Forbindelse 43 er medlem af gap junction proteins-familien; det tillader direkte diffusion af opløste stoffer med lav molekylvægt mellem naboceller. Forbindelse 43 blev rapporteret at være udtrykt af differentierede epitelceller , og fraværet af disse intercellulære kommunikationsmolekyler kan være et træk ved epitelstamceller.

i vores resultater udtrykte en større procentdel af celler p63 og ABCG2, mens få celler udtrykker differentieringsmarkører K3/K12 og CKS43. Således viste humane limbale epitelstamceller i SR serumfrit medium lignende fænotyper og opretholder udifferentierede tilstande sammenlignet med FBS-medium.

som konklusion, ved hjælp af KnockOut SR, der erstatter FBS, opretholder vores nye serumfrie medium vækst og proliferation af humane hornhindeepitelceller og bevarer epitelstamceller i deres udifferentierede fænotype. Denne nye serumfri kulturmetode er suppleringsdefineret og relativt let at kontrollere. Det har et stort potentiale til at blive brugt i klinik limbal epitelcelletransplantation og vævsregenerering.

konkurrerende interesser

forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

anerkendelser

dette arbejde blev støttet af grant fra Jilin University og National Natural Science Foundation of China (NSFC 30500548).