1. KRAS-punkt 2 (kodon 12/13) og punkt 3 (kodon 61) mutationstest: Cobas-bas-Mutationstest til in Vitro-diagnostik (Roche).
Cobas-mutationstesten er en realtids-PCR-test til kvalitativ påvisning af somatiske mutationer i ekson 2 (kodoner 12/13) og ekson 3 (codon 61) af KRAS-genet ved anvendelse af en DNA-indgang på 100 ng. Testen kan detektere 19 KRAS mutationer. Tilstedeværelsen af mutationer påvises med en analytisk specificitet på mindst 99% og en detektionsgrænse på mindst 5% mutantniveau i en baggrund af vildtype genomisk DNA.
Cobas-mutationstesten er baseret på to hovedprocesser: (1) Manuel prøveforberedelse til opnåelse af genomisk DNA fra en eller to 5 liter tykke sektioner af FFPE CRC-væv indeholdende mindst 10% tumorceller; (2) PCR-amplifikation af mål-DNA ved hjælp af komplementære primerpar og to oligonukleotidprober mærket med fluorescerende farvestof. De anvendte primerpar definerer en 85 basepar-sekvens for ekson 2 indeholdende KRAS-kodoner 12 og 13 og en 75 basepar-sekvens for ekson 3 indeholdende KRAS-codon 61 i humant genomisk DNA. Den ene sonde er designet til at detektere KRAS-codon 12/13-sekvensen i ekson 2, og den anden sonde er designet til at detektere KRAS-codon 61-sekvensen i ekson 3 af KRAS-genet. Mutationsdetektion opnås ved smeltekurveanalyse af Cobas 480-analysatoren (1).
2. KRAS-Mutationstest v2 (LSR)
KRAS-Mutationstesten v2 (LSR) er en ALLELSPECIFIK PCR-test i realtid til kvalitativ påvisning og identifikation af ekson 2, 3 og 4 mutationer i V-Ki-ras2 Kirsten rottesarkom viral onkogen homolog (KRAS) gen fra formalinfast, paraffinindlejret væv (FFPET). Testen er designet til at detektere 28 unikke mutationer. Tilstedeværelsen af mutationer påvises med en analytisk specificitet på mindst 99% og en detektionsgrænse på mindst 1% mutantniveau i en baggrund af vildtype genomisk DNA.
KRAS-Mutationstesten v2 (LSR) er baseret på to processer: (1) Manuel prøveforberedelse til opnåelse af genomisk DNA fra FFPET; og (2) PCR-amplifikation og påvisning af mål-DNA ved hjælp af komplementære primerpar og oligonukleotidprober mærket med fluorescerende farvestoffer.
KRAS-Mutationstesten v2 (LSR) bruger primere, der definerer specifikke basepar-sekvenser for hver af de målrettede mutationer. Amplifikation forekommer kun i regionerne af KRAS-genet mellem primerne; hele genet forstærkes ikke. De målrettede KRAS-sekvenser spænder fra 79-114 basepar. Mutationsdetektion opnås gennem PCR-analyse med Cobas 480-analysatoren. (1)
3. BRAF / NRAS-Mutationstest (LSR)
BRAF/NRAS-Mutationstesten (LSR) er en ALLELSPECIFIK PCR-test i realtid til kvalitativ påvisning og identifikation af ekson 11 og 15 mutationer i proto-onkogen B-Raf (BRAF) genet og ekson 2, 3 og 4 mutationer i neuroblastoma Ras viral oncogen homolog (NRAS) genet fra formalinfast, paraffinindlejret væv (FFPET).
testen er designet til at detektere 36 unikke mutationer. Tilstedeværelsen af mutationer påvises med en analytisk specificitet på mindst 99% og en detektionsgrænse på mindst 5% mutantniveau i en baggrund af vildtype genomisk DNA.
BRAF / NRAS-Mutationstesten (LSR) er baseret på to hovedprocesser: (1) Manuel prøveforberedelse til opnåelse af genomisk DNA fra FFPET; og (2) PCR-amplifikation og påvisning af mål-DNA ved hjælp af komplementære primerpar og oligonukleotidprober mærket med fluorescerende farvestoffer.
BRAF / NRAS-Mutationstesten (LSR) bruger primere, der definerer specifikke basepar-sekvenser for hver af de målrettede mutationer. Amplifikation forekommer kun i regionerne i BRAF-eller NRAS-generne mellem primerne; hele genet forstærkes ikke. BRAF-sekvenser spænder fra 101-120 basepar. NRAS-sekvenser spænder fra 94-121 basepar. Mutationsdetektion opnås gennem PCR-analyse med Cobas 480-analysatoren. (2)
klinisk implikation
KRAS og de nationale tilsynsmyndigheder er nært beslægtede Ras-onkogene familiemedlemmer, og mutationer i begge gen ved kodoner 12, 13 (ekson 2), codon 61 (ekson 3) og codon 146 (ekson 4) resulterer i øgede niveauer af GUANOSINTRIPHOSPHATBUNDNE Ras-proteiner. Overaktiv Ras-signalering fremmer onkogenese. I kolorektal carcinom (CRC) findes KRAS-og NRAS-mutationer ved disse kodoner i op til 50% af tilfældene og forudsiger manglende respons på anti-EGFR-behandling. De fleste Ras-mutationer er punktmutationer, der forekommer i KRAS ekson 2 (kodoner 12 eller 13; omkring 40%). Andre Ras-mutationer er mindre hyppige, idet de mest almindelige mutationer forekommer i KRAS-eksoner 3 og 4 og de nationale tilsynsmyndigheders eksoner 2 og 3 (3).
cirka 50% af melanomer har aktiverende mutationer i BRAF. Over 90% af BRAF-mutationer resulterer i et nukleotid 1799 T>en ændring, der fører til en valin-til-glutaminsyresubstitution i position 600 (V600E). BRAF V600E-mutationen forårsager ukontrolleret signalering af MAPK-vejen, der fører til overdreven cellevækst og proliferation. Midler rettet mod aktiveret mutant BRAF (BRAF-hæmmere) har vist sig at være vellykkede hos patienter med metastatisk melanom, der huser denne mutation (1-3).
bortset fra dens forudsigelige værdi i melanom har BRAF V600E-mutationen også prognostisk værdi i kolorektal cancer og i lungekræft (NSCLC) (4,5,7). BRAF v600e-mutationen findes i omkring 10% af metastatisk kolorektal carcinom og har været forbundet med tilstedeværelsen af mikrosatellit ustabilitet (6). Samlet set har patienter med BRAF-mutant CRC lave responsrater på konventionelle terapier og negativ prognose. Mens BRAF V600-muterede melanomer er følsomme over for BRAF-hæmmere, er BRAF V600-muterede CRC ‘ er muligvis ikke så følsomme. Aktivering af EGFR i kolorektal cancer kan forklare, hvorfor kolorektal cancer generelt har et lavere respons på BRAF-hæmmere. Det anbefales derfor at starte kombinationsbehandling med EGFR – og BRAF-hæmmere.
BRAF V600E-mutationen findes også i 3-5% af alle lungekræft (7). Mens BRAF-hæmmere har vist sig at være vellykkede hos v600e-mutationspositive NSCLC-patienter, har FDA godkendt brugen af kombinationsbehandling med BRAF – og MEK-hæmmer til NSCLC-patienter med en V600E-mutation baseret på resultaterne af et internationalt, multicenter, tre-kohorte, ikke-randomiseret, ikke-sammenlignende, åbent forsøg med patienter med lokalt bekræftet BRAF V600E-mutationspositiv metastatisk NSCLC.
Prøvekrav
Acceptable prøver til analysen er formalinfikserede, paraffinindlejrede kolorektale karcinomvævsprøver med en fikseringstid på 6-48 timer.
volumen
1 repræsentativ paraffinblok foretrækkes. Alternativt kræves der for resektionsprøver mindst 5 ufarvede vævssektioner (5 liter tykke) (fuld RAS-test).
opbevarings-og forsendelsesinstruktioner
vedligehold og afsend prøver ved omgivelsestemperatur.
begrænsninger
utilstrækkeligt tumorindhold tillader muligvis ikke påvisning af KRAS/NRAS/BRAF-mutationer: 10% af tumorceller er påkrævet. Tumorindhold evalueres inden analyse, og makrodissektion udføres. Andre fikseringsmidler end formalin eller forlænget fikseringstid kan give anledning til utilstrækkelige resultater.
særlige krav
ingen.
Turn-around-time
5 til 7 hverdage for henholdsvis dias og paraffinblokke.
- Li et al. Et meget verificeret Assay til KRAS-Mutationsdetektion i væv og Plasma af lunge -, kolorektal-og bugspytkirtelkræft. Arch Pathol Lab Med. 2019 Feb;143:183-9
- Patten et al. En følsom og nøjagtig test til samtidig påvisning af 36 BRAF-og NRAS-mutationer. Journal of Clinical Oncology 2018 36:15
- Douillard JY et al. Panitumumab-FOLFOKS4 behandling og Ras mutationer i kolorektal cancer. N Engl J Med. 2013 September 12; 369 (11): 1023-34.
opdateret den 03. December 2019
