Kruppel-lignende faktor 2 (KLF2) regulerer proinflammatorisk aktivering af monocytter

resultater

KLF2-ekspression reduceres med Monocytaktivering/differentiering i makrofager.

for bedre at forstå klf2 ‘ s rolle i reguleringen af immunceller, såsom monocyt/makrofag, vurderede vi først ekspressionen af KLF2 i primære humane monocytter. Som vist i Fig. 1 A venstre, KLF2-ekspression er robust i primære humane monocytter og stærkt reduceret med differentiering til makrofager efter 5 dage. Klf2-ekspression i den humane monocytiske cellelinie THP-1 var meget lavere end i primære humane monocytter. Imidlertid blev ekspression yderligere reduceret ved behandling af disse celler med LPS eller 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetat, to midler, der var veletablerede til at inducere cellulær aktivering eller differentiering (Fig. 1 A Til Højre).

vi forsøgte derefter at afgøre, om KLF2-ekspression er reguleret i den inflammatoriske indstilling in vivo. Monocytisk aktivering er en vigtig patofysiologisk begivenhed i udviklingen af aterosklerose, en kronisk lavgradig inflammatorisk tilstand, så vi begrundede, at klf2-ekspression kan reduceres hos disse patienter (11). Vi undersøgte en gruppe på 14 aldersmatchede normale forsøgspersoner og 14 patienter med omfattende åreforkalkning (50% med historie med kranspulsårerevaskularisering), der stratificeres af de laveste og højeste niveauer af Finkel-Biskis–Jinkins osteosarkomgen (FOS), henholdsvis, som har vist sig at tjene som en markør for betændelse (12). Som vist i Fig. 1 B blev klf2-ekspression signifikant reduceret med 30% af patienterne. I modsætning hertil blev der ikke observeret nogen signifikant effekt for KLF3, KLF6, KLF11 og KLF13. I overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse blev FOS-ekspression signifikant øget hos patienter med koronararteriesygdom (12).

KLF2 hæmmer Monocytaktivering og fagocytisk kapacitet.

som reaktion på inflammatoriske stimuli udtrykker monocytter øgede niveauer af proinflammatoriske faktorer og cytokiner/kemokiner og udviser forbedret fagocytisk kapacitet. For at få indsigt i klf2 ‘ s rolle i monocytfunktion foretog vi overekspressionsstudier. THP-1-celler blev inficeret med enten kontrol tom virus (EV) eller KLF2 (Ad-KLF2) i 24-48 timer og derefter stimuleret med LPS i 2 og 6 timer. som vist i Fig. 2 a, behandling af EV-inficerede celler med LPS (25 ng/ml) resulterede i en robust induktion af cyclooksygenase -2, vævsfaktor og monocytkemoattraktantprotein (MCP)-1 mRNA. I modsætning hertil blev denne induktion markant svækket i KLF2-inficerede celler (Fig. 2 a). Lignende virkninger blev også observeret i musemonocytcellelinjen J774a (data ikke vist). Desuden hæmmede overekspression af KLF2 stærkt sekretionen af forskellige cytokiner og kemokiner. Som vist i Fig. 2 B, klf2 overekspression svækkede den LPS-medierede induktion af faktorer såsom CD40L (med 49,6%), makrofaginflammatorisk protein 1 liter (48,4%), makrofaginflammatorisk protein 1 mg (64,2%), IL-1 liter (55,0%), IL-8 (79,1%), TNF-kurs (50,2%) og MCP-1 (68,8%). Denne effekt var specifik, fordi der ikke blev observeret nogen signifikant effekt på niveauerne af flere andre relevante vækstfaktorer (TGF-Kurt1, blodpladeafledt vækstfaktor og granulocyt-/makrofagkolonistimulerende faktor), cytokiner/kemokiner (IL-4, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-1-Kurt og IFN-Kurt) eller matrice-ændrende stoffer (matrice metalloproteinase type 1, 2, 3 og 9) (data ikke vist).

et klassisk kendetegn ved den aktiverede monocyt/makrofag er fagocytose. For at bestemme, om KLF2-overekspression påvirker monocytternes fagocytiske evne, overudtrykt vi KLF2 eller kontrol (EV) i THP-1-celler, stimuleret med LPS, og vurderede disse cellers evne til at optage. Som vist i Fig. 2 C, kontrolvirusinficerede celler indtog biopartiklerne. I modsætning hertil blev optagelsen af KLF2-ekspressive monocytter markant reduceret (Fig. 2 C). Samlet set viser disse data, at KLF2 kan hæmme monocytsekretion af cytokiner/kemokiner og fagocytose.

KLF2 hæmmer ikke Monocytrekruttering.

vi forsøgte derefter at vurdere effekten af KLF2 på monocytfunktion in vivo. Som reaktion på en skade eller en inflammatorisk stimulus rekrutteres monocytter fra blodbanen til væv. Vi foretog først undersøgelser for at vurdere, om monocytrekruttering blev ændret ved KLF2-ekspression. For at minimere bidraget fra andre celletyper brugte vi C. B-17-Scid-beige mus, der mangler T, B og naturlige dræberceller. Disse dyr (n = 5 pr.gruppe) blev derefter udsat for total-kropsbestråling og rekonstitueret med j774a-celler adenoviralt inficeret med enten kontrolvirus (EV) eller KLF2 ved hjælp af haleveinjektion (beskrevet i materialer og metoder). Dyr blev derefter udsat for IP-injektion af thioglycolat (en potent kemisk irritation, der inducerer monocytrekruttering), og antallet af GFP-positive celler blev vurderet 48 timer senere ved strømningscytometrisk analyse. Som vist i Fig. 2 C og D hæmmede KLF2 ikke rekrutteringen af GFP+ J774a-monocytter til bughulen. Faktisk observerede vi reproducerbart, at KLF2-transducerede dyr udviste en signifikant stigning i GFP + celler. Disse data antyder, at KLF2 ikke hæmmer, men snarere øger monocytisk rekruttering til et inflammatorisk sted.

KLF2 hæmmer carrageenan-induceret Inflammation.

efter rekruttering og migration til væv udskiller monocytter cytokiner, kemokiner og vækstfaktorer for at opretholde det inflammatoriske respons. Som vist i Fig. 2 B bemærkede vi, at KLF2 overekspression svækkede udarbejdelsen af flere cytokiner og kemokiner. For at afgøre, om KLF2 påvirker monocytisk proinflammatorisk funktion, brugte vi en veletableret model til betændelse: carrageenan-induceret fodpadinjektion. Injektion af dette kemikalie har tidligere vist sig at reproducerbart inducere en inflammatorisk respons karakteriseret ved poteødem (13-15). C. B-17-Scid-beige mus (n = 4 pr.gruppe) blev bestrålet som beskrevet ovenfor, rekonstitueret med kontrol-eller KLF2-ekspressive j774a-celler og derefter udfordret med carrageenan-injektion i fodpladen (beskrevet i materialer og metoder). Potevolumen blev bestemt ved anvendelse af et hydroplethismometer modificeret til små volumener (Ugo Basile, Milano). Som vist i Fig. 2 F, EV-inficerede dyr udviste en stigning på 17 liter 1,08-mm3 og 23,3 liter 3,05-mm3 i potevolumen efter henholdsvis 1 og 2 timer carrageenan-injektion. I modsætning hertil udviste dyr, der var rekonstitueret med KLF2-udtrykkende j774a-celler, kun en 6,25 liter 0,85-mm3 og 7,5 liter 0,95-mm3 stigning i potevolumen ved henholdsvis 1 og 2 timer efter carrageenan-injektion (Fig. 2 F). I overensstemmelse med denne bruttoeffekt afslørede histologisk analyse af poterne reduceret væskeekstravasation, hvilket fører til dannelse af ødem (Fig. 2 g, pile).

effekt af KLF2 nedslag på inflammatorisk genekspression.

for at bestemme betydningen af KLF2 i monocytisk inflammatorisk genekspression blev der også foretaget små interfererende RNA (siRNA)-medierede nedslagsundersøgelser. Som vist i Fig. 2 timer, sammenlignet med ubehandlede (kontrol) og ikke-specifikke siRNA-behandlede celler, resulterede nedslagning af KLF2 (60% nedslag) i j774a-celler i en induktion af inflammatoriske gener såsom MCP-1 og en mere beskeden effekt på koks-2 og vævsfaktorekspressionsniveauer. Disse resultater blev også verificeret med realtids PCR-analyse (Fig. 2 I).

KLF2 hæmmer NF-kB og AP-1 Promotoraktiviteter.

KLF2 kan kraftigt hæmme LPS-medieret induktion af MCP-1, koks-2 og vævsfaktor (Fig. 2 a). Induktionen af disse mål ved proinflammatoriske stimuli vides at være reguleret af transkriptionsveje såsom NF-kB og AP-1. Vi begrundede det, i princippet, KLF2 kan hæmme disse veje på flere niveauer såsom ekspression, DNA-binding, eller induktion af transkriptionel aktivitet.

vi fokuserede først på NF-kB givet sin centrale rolle i inflammation. Overekspression af KLF2 ændrede ikke nuklear akkumulering af p65 eller nukleare niveauer af IkB-kinase (IKK) liter og IKKy (Fig. 3 a). Desuden ændrede KLF2-overekspression ikke kinetikken af IkB-phosphorylering eller nedbrydning eller cytoplasmatiske niveauer af IKKa, ikk-kar og IKKy (Fig. 3 B). I overensstemmelse med disse observationer påvirkede KLF2 ikke NF-kB-binding til DNA. Som vist i Fig. 3 C, behandling af kontrolvirusinficerede celler (EV) med LPS inducerede et enkelt hovedbånd. Konkurrence-og supershift-undersøgelser bekræftede, at dette band repræsenterer NF-kr. Et næsten identisk mønster af NF-kB-binding blev observeret i klf2-overudtrykkende celler. For at vurdere, om KLF2 kan påvirke NF-kB-medieret transkriptionel aktivering, blev der foretaget genreporteranalyser. Som vist i Fig. 3 D, transfektion af p65 med en NF-kB luciferase reporter plasmid induceret transkriptionel aktivitet ved kr11 fold. Denne induktion blev kraftigt reduceret i nærvær af KLF2, hvilket indikerer, at KLF2 hæmmer NF-kB-transkriptionsaktivitet. Lignende virkninger af KLF2 blev observeret for AP-1-vejen (Fig. 5 A-C, som offentliggøres som understøttende information på PNAS ‘ hjemmeside).

rekruttering af coactivator CBP-associeret faktor (PCAF) af KLF2 som en samlende mekanisme.

samlet set er resultaterne i Fig. 3 indikerer, at KLF2 kan hæmme NF-kB-medieret transaktivering uafhængig af effekter på DNA-bindingen af disse faktorer. En mulig mekanisme er rekruttering af kritiske coactivators. For eksempel kræver optimal NF-kB-binding interaktion med flere nøglekoaktivatorer, såsom steroidreceptor coactivator (SRC)-1, PCAF og p300/CBP. KLF2 kan interagere med en eller flere af disse faktorer, rekruttere dem væk fra NF-kB og som følge heraf reducere NF-kB-medieret transkriptionsaktivitet.

for at bestemme PCAF ‘ s rolle i KLF2-medieret hæmning af NF-kB-transkriptionsaktivitet udførte vi cotransfektionsundersøgelser med eksogen PCAF. Transfektion af PCAF (men ikke p300; data ikke vist) reddede signifikant KLF2-medieret undertrykkelse af NF-kB concatemer (Fig. 4 A). En delvis redning blev også observeret på KLF2S evne til at hæmme AP-1 transkriptionsaktivitet (Fig. 5D). For at afgøre, om KLF2 og PCAF interagerer med hinanden, udførte vi GST-nedtræknings-og coimmunopræcipitationsanalyser. Ved hjælp af in vitro transkriberede og oversatte produkter fandt vi, at KLF2 og PCAF kan interagere direkte i et cellefrit system (Fig. 4 B). For at vide, om PCAF binder til KLF2 in vivo, overudtrykt vi KLF2 (hæmagglutinin-mærket) og PCAF (Flag-mærket) i COS-7 celler. Immunudfældning med et Anti-Flag-antistof efterfulgt af vestlig blotting med et anti-hæmagglutinin-antistof viste, at KLF2 binder med PCAF i celler (Fig. 4 C).

for at afgøre, om de mekanismer, der ligger til grund for de observerede effekter, er operative in vivo, foretog vi kromatinimmunudfældning (ChIP) undersøgelser. Som forventet førte LPS-stimulering af THP-1-celler til rekruttering af p65 og PCAF til koks-2-promotoren (Fig. 4 D). Derudover blev der observeret samtidig acetylering af HH3 og HH4. I forbindelse med KLF2-overekspression er PCAF-rekruttering og histonacetylering imidlertid begge stærkt svækket (Fig. 4 D). I overensstemmelse med vores gel-shift-analyser blev der ikke observeret nogen signifikant effekt af KLF2 på P65-rekruttering.