Diskussion
den observerede produktion af høje niveauer af proteaseaktivitet under kontinuerlig kultur af K. sedentarius lettede oprensningen af to proteaser, P1 og P2, som var aktive mod asocasein, insulinkæden, keratin ekstraheret fra human callus og uforarbejdet callus. De generelle egenskaber ved disse stoffer, herunder substratområde, optimal temperatur og pH og følsomhed over for proteasehæmmere antyder, at de er biokemisk ens og sandsynligvis hører til den alkaliske serinproteasefamilie. Disse proteaser produceres af en lang række mikroorganismer og fungerer som endopeptidaser (Rao et al. 1998).
om keratinaser også kan klassificeres som keratinaser, er dog stadig et spørgsmål om debat. Definition være i stand til at hydrolysere rent nativt keratin. Ekstraktion af keratin kan imidlertid kun opnås ved forudgående behandling med denatureringsmidler for at adskille det fra ikke‐keratinproteiner. Mekaniske behandlinger såsom kuglefræsning resulterer i spaltning af disulfidbindinger, hvilket gør proteinet mere modtageligt for proteolytisk fordøjelse af proteaser såsom trypsin og proteinase K, som ikke er klassificeret som keratinaser (Noval og Nickerson 1959). Tilsvarende er brugen af varmesteriliserede substrater i keratinaseanalyser også blevet kritiseret, fordi opvarmning kan forårsage keratindenaturering.
skønt finmalet callus i den foreliggende undersøgelse blev anvendt som et substrat, var kultur-supernatantvæske aktiv mod stykker af intakt callus. Derfor, selvom de to proteaser ikke er strengt keratinaser, nedbryder de humant callus in vitro, og der er nogle beviser for, at dette også forekommer in vivo (Nordstrom et al. 1987).
proteaser er også blevet klassificeret som keratinaser som følge af deres aktivitet på reduceret keratin, i hvilket tilfælde reduktionsmidler enten er blevet tilsat til assayblandingen eller anvendt under keratinekstraktion. Selvom den keratinolytiske aktivitet af en række kutane bakterier er blevet undersøgt ved anvendelse af ‘nativt’ keratin som substrat, blev reduktionsmidlet, dithiothreitol (DTT), inkluderet i assayblandingen. For eksempel, når tilsyneladende keratinaseaktivitet fra Staphylococcus epidermidis blev undersøgt i fravær af DTT, blev der ikke påvist nogen aktivitet (Mikk og de Jong 1987). Tilsvarende er en serinprotease fra Candida albicans‐nedbrudte keratiner, der var blevet ekstraheret fra stratum corneum af humane såler med 8 mol l−1 urinstof i Tris‐HCl og Lars‐mercaptoethanol (Hattori et al. 1984). I den foreliggende undersøgelse hydrolyserede P1 og P2 keratin, der var blevet ekstraheret fra human fod callus med urinstof og kurs‐mercaptoethanol, men vigtigst af alt var det også i stand til at nedbryde ubehandlet callus.
stratum corneum og human callus er en kompleks og stabil struktur, hvoraf keratin er en vigtig komponent. Der er 30 humane gener for keratin, hvoraf 18 udtrykkes på huden (Fuchs 1995). En oversigt over keratindatabasen har vist, at hvert keratin har potentielle spaltningssteder for proteaser, og Asp‐Arg og Gly‐Arg er de mest almindelige. Hvis keratinfilamenterne oprindeligt brydes på disse steder, er det muligt, at gradvis nedbrydning af disse mindre enheder forekommer på sekundære spaltningssteder, der producerer et størrelsesområde af peptidfragmenter, som vist ved analyse af proteaseangrebet på keratiner ekstraheret fra human callus. Resultaterne præsenteret i Fig. 3b angiver to pH-optima for den callusnedbrydende aktivitet af P2. En mulig forklaring er, at der er to tegn i prøven. Dette forekommer usandsynligt, fordi den anvendte prøve var stærkt oprenset, som vist på side med sølvfarvning (se Fig. 1, bane 6). Muligheden for to callusnedbrydende stoffer i den oprensede P2‐prøve med en meget lignende mobilitet på side kan ikke udelukkes. Den samme prøve blev imidlertid testet ved hjælp af de samme buffere med assayet, og kun et pH-optimum blev detekteret ved pH 10·2. En alternativ forklaring er, at det komplekse callussubstrat/fsym-interaktion ved forskellige pH ‘ er er en balance mellem fsymaktivitet og subtile konformationsændringer af substratet, hvilket fører til dobbelt pH optima.
denne undersøgelse har vist, at K. sedentarius producerer to ekstracellulære proteaser, der har callusnedbrydende aktivitet. Grundlæggende oplysninger om deres relative molekylære størrelser, deres Pi ‘ er, er blevet bestemt. Imidlertid kunne konventionelle kinetiske undersøgelser ikke behandles, fordi det naturlige substrat, der blev anvendt i disse in vitro-eksperimenter, var en kompleks blanding af polymerer, uopløselig i vand. Den øgede aktivitet af P2 i nærvær af 800 mmol 1-1 salt kan være relevant for mikroorganismens overlevelse på menneskelig hud, som har en skiftende saltkoncentration afhængigt af den eccrine kirtelaktivitet bestemt af personens træningshastighed og miljøtemperaturer. Den eller de mekanismer, der er involveret i natriumchlorideffekten, er ikke blevet behandlet. Det foreslås foreløbigt, at natriumchlorid kan påvirke enten den tertiære struktur af substratet eller begge dele for at forbedre adgangen til det aktive sted til substratets specifikke spaltningssteder.
den enkleste forklaring på de observerede resultater er, at der i en kultur supernatant af K. sedentarius er to callusnedbrydende ensymer, serinproteaser, som også opløser humant keratin til stede i callus. Det er muligt, at K. sedentarius producerer en protease, kodet af et gen, og at autokatalytisk eller anden proteaseaktivitet producerer to forskellige molekylvægte. Alternativt er der to gener, der koder for to uafhængige og nært beslægtede. Sidstnævnte hypotese understøttes af en tidligere undersøgelse (Holland et al. 1992). Prøver fra kontinuerlig kultur af K. sedentarius ved steady state ved forskellige fortyndingshastigheder analyseret på side, og overlejret med kasein, viste to bestanddele, den ene konstitutive og den anden påvist ved høje koncentrationer ved lave fortyndingshastigheder. Det er vigtigt, at det ikke blev detekteret ved fortyndingshastigheder i nærheden af lusmaks. Bestemmelse af den N‐terminale aminosyresekvens af P1 (21 rester) og P2 (15 rester) polypeptider viste, at de var helt forskellige. Dette resultat, taget sammen med oplysningerne fra det kontinuerlige kultureksperiment, antyder, at de er kodet uafhængigt.
resultaterne af denne undersøgelse har styrket hypotesen om, at specifikke proteaser af K. sedentarius kan redegøre for nedbrydningen af callus karakteristisk for pitted keratolyse. Beviserne til dato antyder også, at to proteaser er involveret, og at de er aktive ved pH på hudstedet, pH 6·3-6·9 (Marshall et al. 1988). Fortolkningen af resultater opnået fra in vitro-eksperimenter til in vivo-miljøet kan stilles spørgsmålstegn ved, selvom human callus blev brugt som substrat. Ideelt set bør humane hudbiopsier tages, herunder områder med normal og pitted hud. Tilstedeværelsen og placeringen eller fraværet af proteaserne kan derefter bestemmes ved histologiske teknikker ved anvendelse af monoklonale antistoffer som prober til proteaserne og K. sedentarius. Imidlertid ville etisk godkendelse ikke blive givet for biopsier fra det krævede sted, fodens bærende sted, fra et repræsentativt antal mennesker. Inddragelsen af K. sedentarius i pitted keratytosis ved en mekanisme til produktion af proteaser, der nedbryder keratin, er ikke formelt bevist. Der er dog ingen beviser, der tilbageviser hypoteserne, og dens troværdighed er blevet styrket af de resultater, der præsenteres her. Der er fremlagt stærke in vitro-beviser, der implicerer K. sedentarius og dets ekstracellulære callusnedbrydende symptomer i tilstanden pitted keratolyse. Ved normal hud pHs og overfladehydrering vil produktionen og aktiviteten af disse stoffer være lav, idet P1 er den mere aktive. Under miljøforhold med okklusion og på dårlig hygeine bevæger hudens pH sig til og lidt over neutraliteten. Disse betingelser favoriserer P2. K. sedentarius at opnå kulstof-og nitrogenkilder, små peptider, låst i den residente og uopløselige komplekse polymer, keratin. På nuværende tidspunkt er reguleringen af produktionen af disse stoffer ukendt, ligesom deres relative bidrag til nedbrydning af callus in vivo. Ud over de kliniske implikationer har keratinolytiske proteaser betydelig værdi for den kommercielle sektor, da de er nyttige i en række industrielle processer, herunder nedbrydning af keratinaffald fra fjerkræ‐og læderindustrien (Shih 1993; Onifade et al. 1998). Den høje keratinolytiske aktivitet af K. sedentarius proteaser ved relativt lave temperaturer og pH, sammenlignet med mange andre proteaser, præsenterer en potentiel anvendelse af disse proteaser i den bioteknologiske industri.
