Sebrafisk vedligeholdelse og bestande: Sebrafisk (Danio rerio) blev hævet og iscenesat i henhold til etablerede protokoller30.Anvendte transgene linjer var Tg(kdr-l:ras-mCherry)s91631, TG(fli1ep:Lifeact-EGFP)sf49532, Tg(fli1:myr-EGFP)ncv233, Tg(fli1:myr-MCHERRY)ncv134, Tg(fli1:Lifeact-MCHERRY)ncv733, Tg(fli1:GAL4FF)ubs37, TG(UAS:EGFP-UCHD) ubs1835, TgBAC(pdgfrb:GFP)ncv2236 og Tg (kdrl:EGFP)s84337. Alle dyreforsøg blev godkendt af institutionel Animal Care and Use Committee i Riken Kobe Branch (iacuc).
plasmider og oligonukleotider: Sebrafisk marcksl1a, marcksl1b og fscn1a blev klonet ved hjælp af PCR fra cDNA af 1 DPF-embryoner ved hjælp af Neb-Karr PCR-Kloningssæt. Alle ekspressionskonstruktioner, der blev brugt i denne undersøgelse, blev genereret via porten til krop-kloning og/eller in-Fusion-krop-kloning ved hjælp af plasmider fra Tol2Kit38. Plasmider med muteret Marcksl1a og Marcksl1b blev genereret ved hjælp af 5.kvartal-styret mutagenesesæt (Neb). shRNA indeholdende vektorer blev konstrueret ved ligering af shRNA-sekvensen mellem EcoRI-og PmeI-stederne nedstrøms for U6-promotoren af modificeret pEGFP-U6 vektor39 (en gave fra Addgen plasmid #19799). Målsekvens for human MARCKSL1 er 5 ‘- GTGTGAACGGAACAGATGATG-3’. Den krypterede shRNA-sekvens 5′-GAGTCATGGGTCAGTTATATG-3 ‘ blev designet som en uoverensstemmende sekvens (understreget) af MARCKSL1 shRNA. Vektorer indeholdende mus Marcksl1, Marcksl1-S120A/T148A/T183A (Marcksl1-AAA) og Marcksl1-s120d/T148D/T183D (Marcksl1-DDD) subkloneret i pEGFP-N1 (Clontech)10 var gaver fra Eleanor T. Coffey (University of Turku). En detaljeret information om plasmider og primere anvendt i denne undersøgelse kan findes i henholdsvis supplerende tabel 1 og 2.
RNA-isolering og cDNA-syntese: Det samlede RNA blev isoleret ved hjælp af TRI-reagens (epigenetik), og det direkte RNA-Mikroprep-sæt blev syntetiseret ved hjælp af SuperScript III-førstestrengssyntesesystemet (Invitrogen) i henhold til producentens protokoller.
mosaik udtryk for konstruktioner og transgene sebrafisk linjer: Tol2-baserede ekspressionskonstruktioner (5-10 pg) blev co-injiceret i en-celle fase sebrafisk embryoner med 50 pg Tol2 transposase mRNA transskriberet fra NotI-lineariseret pCS-TP vektor (en gave fra Koichi Kavakami, National Institute of Genetics, Japan) ved hjælp af mMESSAGE mMACHINE SP6 kit (Invitrogen). Til mosaikekspression af transgener blev embryoner analyseret ved 1 eller 2 dpf efter injektioner. For at generere TG(fli1ep:myl9b-EGFP)rk25 og TG (fli1ep:EGFP-PLC1 Rk26 linjer blev injicerede embryoner rejst til voksne og screenet for grundlæggere.
Generation af sebrafisk marcksl1a og marcksl1b mutanter: marcksl1a mutanter blev genereret af CRISPR/Cas9-medieret mutagenese. En enkelt-guide RNA (sgRNA) rettet mod den anden ekson (supplerende Fig. 4a) blev genereret ved hjælp af kloningsuafhængig protokol40. Cas9 / sgRNA RNP-kompleks blev samlet lige før injektion, og efter 5 min inkubation ved stuetemperatur blev 200 pg Cas9-protein (Invitrogen) og 100 pg sgRNA samtidig injiceret i etcellet Stadium Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)sf495;Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916 embryo. marcksl1b mutanter blev genereret af TALEN-medieret mutagenese. TALEN rettet mod den første ekson af marcksl1b (supplerende Fig. 4b) blev designet ved hjælp af TAL Effector nukleotid Targeter 2.0 (https:// tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen-old) og blev samlet via Golden Gate-metoden41. TALEN-gentagne variable di-rester (RVD ‘er) blev klonet til en Rciscript-GoldyTALEN-vektor (Addgen) og begrænsede mRNA’ er for hver tale blev in vitro transkriberet fra SacI-lineariserede ekspressionsplasmider ved hjælp af mMESSAGE mMACHINE T3 kit (Invitrogen). Etcellet Stage Tg (fli1ep: Lifeact-EGFP)sf495;Tg (kdr-l:Ras-mCherry)s916-embryoner blev mikroinjiceret med 200 pg RNA (100 pg af hver venstre og højre tale mRNA ‘ er). F0-grundlæggere blev identificeret ved at krydse TALEN eller CRISPR/Cas9-injiceret fisk med vildtype fisk og screening af afkom for mutationer ved 2 dpf ved hjælp af T7 endonuclease i (NEB) assay (for TALEN-injiceret fisk) eller Sanger sekventering (for CRISPR/Cas9-injiceret fisk). Kort fortalt blev genomisk DNA isoleret fra grupper på fem embryoner ved hjælp af HotSHOT-metode42, og tilsvarende genomiske regioner blev forstærket. Mutationer blev vurderet ved direkte sekventering af oprensede PCR-produkter. F1-afkom af positiv F0 blev hævet til voksen alder, og heterosygøse bærere til mutationer blev identificeret ved finklipning og rutinemæssig genotypebestemmelse af PCR-analyse under anvendelse af de samme primere.
seks mutante alleler i marcksl1a og fem mutante alleler i marcksl1b blev identificeret under screeningen (supplerende Fig. 13). Allel rk23 har en 2-nt-deletion, der fører til en frameshift efter aminosyre 51 og for tidligt stopkodon ved aminosyre 56 efter 5 missense-aminosyrer (supplerende Fig. 4a, c). Allel rk24 har en 5-nt-deletion, der fører til en frameshift efter aminosyre 13 og for tidligt stopkodon ved aminosyre 17 efter 4 missense-aminosyrer (supplerende Fig. 4b, d). Af disse grunde betragter vi marcksl1ark23 og marcksl1brk24 som nulalleler og fokuserede vores undersøgelser på analyserne af disse mutanter.
levende billeddannelse: embryoner blev monteret i 0,8% lavmelt agarose (Bio-Rad) i E3-medium indeholdende 0,16 mg/mL Tricain og 0,003% phenylthiourinstof. Konfokal stakke blev erhvervet ved hjælp af et omvendt Olympus IKS83 / Yokogava CSU-V1 roterende disk konfokalt mikroskop udstyret med et 4,2 CMOS-kamera (Andor). Lyse feltbilleder blev erhvervet på Leica m205fa mikroskop. Billeder blev behandlet ved hjælp af Fiji (NIH).
laserablation: Laserablationer blev udført ved hjælp af et 405 nm laser (Andor) og frappa-modul (Andor) monteret på et omvendt Olympus IKS83/Yokogava CSU-V1 konfokalt mikroskop med et Olympus UPLSAPO 60 gange/NA 1.2 vand nedsænkningsmål. Tre sekventielle laserablationer med en opholdstid på 1000 liter blev hver påført ved 51% laserkraft.
Mikroangiografi: Mikroangiografi blev udført i vildtype, marcksl1ark23, marcksl1brk24 og marcksl1ark23;marcksl1brk24 embryoner. I alt blev 2 og 3 DPF-embryoner injiceret med 1-2 nl-dekstrantetramethylrhodamin eller dekstranfluorescein (mv = 2000 kDa, Invitrogen) ved 10 mg/mL og afbildet straks. Konfokale stakke blev erhvervet med et Olympus UPLSAPO 10 liter/NA 0.4 mål. For at dække hele embryoet blev flere regioner afbildet og syet ved hjælp af Stitching plugin i Fiji43.
celletransplantation: grupper på 15-25 donorceller fra marcksl1ark23;marcksl1brk24 mutante embryoner i Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916 baggrund blev opsamlet fra en tilfældig position i blastoderm og transplanteret til den laterale marginalområde i blastoderm44 af vildtype modtagerembryoner ved 4,5–6 hpf. Ekstraktion og transplantation blev udført ved anvendelse af en CellTram Kurt 4r olie mikroinjektor (Eppendorf) med en borosilikatglaskapillær GC100-15 (Harvard Apparatus Ltd) Udformet med en vandret mikropipette puller P-87 (Sutter Instrument Co.) og en MF-900 microforge (Narishige) for at opnå en ‘ske’ form glat spids. Under transplantation embryoner, hvor de opbevares i agarosebelagte petriskåle med 0,5 E2 buffer . Ved 2 dpf blev embryoner med mCherry-positive ISV ‘ er valgt til mikroangiografi og billeddannelse. I alt otte uafhængige transplantationer blev udført.
kemiske behandlinger: Latrunculin B (Merck Millipore) blev opløst i DMSO til 1 mg/ml og opbevaret ved -20 liter C. CK666 (SIGMA) blev opløst i DMSO til 50 mM og opbevaret ved 4 liter C. alle forbindelser blev fortyndet til den ønskede koncentration i E3-Buffer.
transfektion, siRNA-medieret proteinnedslag og forskydningsspændingseksperiment: HUVECs (Lone, C-2519a) blev dyrket i EGM-medium (Lone) og anvendt indtil passage 4. Til plasmidtransfektioner blev celler podet i Opti-MEM-medium (Gibco) ved 5,8 liter 104 celler/cm2 på poly-L-lysin og gelatinebelagte dækglas og transficeret med 2 liter plasmid under anvendelse af Lipofectamine 3000 (Thermofisher Scientific). To timer efter transfektion blev Opti-mem-medium ændret til EGM-medium uden antibiotika. Til siRNA-transfektion, HUVECs (7.9, 104 celler / cm2) blev transficeret med 20 nM siRNA under anvendelse af DharmaFECT1-reagens (Dharmacon). Transfektion blev gentaget efter 24 timer. celler blev dyrket i yderligere 24 timer før total RNA-ekstraktion eller fiksering. On-TARGETplus human MARCKSL1 siRNA-SMARTpool (Dharmacon) blev brugt til at slå MARCKSL1 ned. On-TARGETplus non-target pool (Dharmacon) blev brugt som kontrol siRNA transfektion. Celler blev fikseret med 4% PFA / PBS, permeabiliseret med 0,1% Triton * 100 og farvet med 14 liter DAPI til kernemærkning, Aleksa 568-phalloidin (1:1000, ThermoFisher Scientific) til visualisering af F-actin og anti-VE-cadherin antistof (1:100, cellesignalering) efterfulgt af anti-kanin Aleksa 488 sekundært antistof (1:1000, Thermofisher Scientific) for at markere EC-kryds.
til forskydningsspændingseksperimenter blev HPAEC (Lone) dyrket ved 1000-1500 celler/mm2 på 1% gelatinebelagt skål i EGM-2 medium (Lone) og anvendt før passage 9. Cellerne blev udsat for statisk eller laminær forskydningsspænding ved 15 dyn/cm2 i 0,5, 1 eller 6 timer ved anvendelse af et parallelt pladetypeapparat 45,46. Den ene side af strømningskammeret bestod af en 1% gelatinebelagt glasplade, hvorpå de dyrkede HPAECs hvilede, og den anden side bestod af en polycarbonatplade. Deres flade overflader blev holdt 200 liter fra hinanden med en Teflon pakning. Kammeret var forsynet med en indgang og en udgang til væsken, og indgangen var forbundet med et øvre reservoir med et silikonrør. Udgangen var åben til et lavere reservoir. Strømmen blev drevet af en rulle/rørpumpe. Væsken (EGM-2-medium) passerede fra det øvre reservoir gennem strømningskammeret ind i det nedre reservoir. Strømningshastigheden blev overvåget med en ultralyds transittidsstrømningsmåler (HT107, Transoniske systemer) placeret ved indgangen, og den blev styret ved at ændre højdeforskellen mellem det øvre reservoir og udgangen af strømningskammeret. Intensiteten af forskydningsspændingen (larr, dynes/cm2), der virker på EF-laget, blev beregnet ved hjælp af formlen larr = 6 larr/a2b, hvor larr er viskositeten af perfusatet (poise), K er strømningsvolumen (ml/s), og a og b er tværsnitsdimensionerne af strømningsbanen (cm). Efter forskydningsspændingseksponering blev Total RNA isoleret til kpcr.
kvantitativ realtids-PCR: kpcr blev udført ved anvendelse af 1 liter cDNA, genereret ud fra 150 ng (Hpaec) eller 500 ng (Huvec) af total RNA, i en 10-liters reaktionsblanding indeholdende 1% Luna Universal kpcr Masterblanding (NEB) og 400 nM frem-og bagprimere. Reaktionerne blev kørt på ABI Prism 7900ht instrument i firedoblet. Data blev analyseret ved hjælp af programmet Applied Biosystems (Applied Biosystems), og marcksl1 mRNA relativ ekspression blev beregnet med 2−Kurt-Metoden47 ved anvendelse af GAPDH som referencegen.
hele mount in situ hybridisering: Hele mount in situ hybridisering blev udført i henhold til standardprotokol48. Embryoner blev fikseret i 4% PFA ved 24, 48 og 72 hpf og permeabiliseret med 10 liter/mL proteinase K. hybridisering blev udført i buffer indeholdende 5% natriumdekstransulfat (mv = 500 kDa) ved 70 liter C natten over. Efter strenghedsvask blev prøverne blokeret med 2% blokerende reagens (Roche) i maleinsyrebuffer og inkuberet natten over med anti-digoksigenin (DIG) antistof, konjugeret med alkalisk phosphatase (Roche, 1:5000) ved 4 liter C. embryoner blev farvet med NBT/BCIP-opløsning (Roche) i farvningsbuffer . Embryoner blev ryddet i 70% glycerol natten over og afbildet ved hjælp af Leica M205FA mikroskop. Marcksl1a og marcksl1b DIG-mærket 1,2 kb lange riboprober blev genereret fra plasmider, der koder for cDNA ‘ erne i fuld længde ved hjælp af MEGAscript SP6 eller T7-sæt (Invitrogen).
enkeltcellet RNA-sekventering: ECs blev isoleret fra TG(kdrl:EGFP)s843 transgene embryoner. Cellesortering blev udført med FACSAriaII Cell Sorter (BD Bioscience). Encellet suspension blev indlæst i 10 gange Kromsystemet, og cDNA-biblioteker blev konstrueret ved hjælp af krom næste perle enkeltcelle 3′ perle, bibliotek og Gel perle Kit v2 (10 gange genomik) i henhold til producentens protokol. Biblioteket blev sekventeret på Illumina Hisek 1500 Sekvensator (Illumina, USA). Cell Ranger v2. 1 blev brugt til at de-multipleks rå base call (BCL) filer genereret af Illumina sekvensatorer i fastk filer, udføre justeringen, stregkode optælling, og UMI optælling. Sekventering læser blev kortlagt til sebrafisk genom samling (Grcc11, Ensembl frigivelse 92). Yderligere analyser blev udført ved hjælp af Seurat package49 i R-programmer (https://www.r-project.org). Ekspressionsmatricerne blev først filtreret ved at holde gener, der udtrykkes i mindst 3 celler og celler, der udtrykte mindst 200 gener til nedstrømsanalyse. Celler blev yderligere filtreret ved at vælge for celler, der udtrykker lavt mitokondrielt indhold (<7%). Dataene blev derefter normaliseret ved hjælp af Normaliseretdatafunktion, som normaliserer genekspression for hver celle med den samlede ekspression.
kvantificering af blodkardiameter:levende Tg(fli1ep: Lifeact-EGFP)sf495;Tg (kdr-l:ras-mCherry) s916 transgen vildtype eller marcksl1 mutante embryoner blev afbildet ved 50-52 hpf. Konfokale stakke blev erhvervet med et Olympus UPLSAPO 40 liter/NA1.25 silicone oil immersion mål. For beregninger af DA-og PCV-diameter blev der foretaget 4-5 målinger mellem ISV ‘er langs æggeblommeforlængelsen (ISV’ er nr. 10-14). For ISV-diameter blev der i gennemsnit foretaget 6 målinger langs hver ISV (ISV ‘ er nr.10-14) mellem DA og DLAV. Målinger blev udført ved hjælp af Fiji (NIH).
kvantificering af EF-antal og spredning: For at tælle EC-nummer blev 52 hpf vildtype, marcksl1ark23, marcksl1brk24 eller marcksl1ark23;marcksl1brk24-embryoner i Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916-baggrund fikseret i 4% PFA og farvet med 3 liter DAPI. Konfokale stakke blev erhvervet med et Olympus UPLSAPO 40 gange/NA 1.25 silicone oil immersion mål. Kerner blev talt i hver ISV (ISV ‘ er nr. 9-22) mellem DA og DLAV. At kvantificere mitotiske ECs i ISV ‘ er, vildtype eller marcksl1ark23; marcksl1brk24-embryoner i Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)sf495;Tg (kdr-l:Ras-mCherry)s916 baggrund blev fikseret i 4% PFA ved 30, 36 og 48 hpf, permeabiliseret i 1% DMSO/1% Triton H-100 og farvet med anti-phospho H3 antistof (1:250, Merck Millipore) efterfulgt af anti-kanin Aleksa 488 sekundært antistof (1:1000, Thermofisher Scientific) og 3 liter DAPI. Konfokale stakke blev erhvervet med et Olympus UPLSAPO 40 gange/NA 1.25 silicone oil immersion mål. Mitotiske celler (pH3-positive celler) blev talt i ISV ‘er på begge sider af embryoet (ISV’ er nr. 9-22). ISV ‘ er blev visualiseret ved hjælp af mcherry fluorescens. Kun en pH3-positiv celle pr. ISV blev detekteret uanset ISV-position. Under tællingen betragtede vi EC i telofase som en enkelt celle. For at tælle antallet af EC-divisioner, vildtype eller marcksl1ark23;marcksl1brk24 embryoner i Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)med 495;Tg(kdr-l:ras-MCHERRY)s916 baggrund blev afbildet fra 24 Til 48 hpf med 6 min intervaller ved hjælp af et Olympus UPLSAPO 30 liter/NA 1.05 silicone oil immersion objective. Antallet af celledelinger i hver ISV (ISV ‘ er nr. 11-15) blev kvantificeret.
kvantificering af actomyosinniveauer i apikalbarken: levende Tg (fli1: Lifeact-mCherry)ncv7; Tg(fli1ep:EGFP-PLC Krist1ph)rk26 og Tg(fli1ep:myl9b-EGFP)rk25; Tg (kdr-l:ras-mCherry)s916-sebrafiskembryoner blev afbildet ved 30-34 hpf ved hjælp af et Olympus UPLSAPO 60 Kurt/NA 1.2 vand nedsænkningsmål. Intensiteten af Lifeact eller Myl9b langs den apikale bark og i cytoplasmaet blev målt ved hjælp af Fiji. Forholdet mellem gennemsnitlig kortikal og cytoplasmatisk intensitet blev beregnet.
in vivo celleformanalyse: enkeltcellemærkning af ECs i ISV ‘ er blev opnået ved mosaikekspression af enten fli1ep: lynEGFP plasmid i vildtype, marcksl1brk24 eller marcksl1ark23; marcksl1brk24 mutante embryoner eller fli1ep:marcksl1b-EGFP plasmid i vilde embryoner. Ved 2 dpf blev der udført mikroangiografi, og kar blev afbildet med et Olympus UPLSAPO 60 liter/NA 1,2 vanddypningsmål med optiske Flyinterval på 0,25 liter. Celleformanalyse af ECs af ISV ‘ er blev udført på en semi-automatiseret måde ved hjælp af et specialskrevet ImageJ-script udviklet i Python, udvidelse af metoden beskrevet i ref. 50. Billeder blev først groft beskåret for at reducere nedstrøms hukommelseskrav, og yderligere metadata (fartøjstype og embryoidentifikator) blev befolket. Et separat script blev derefter kørt for at projicere og pakke celler fra omkring et fartøj på en 2D-overflade. Kort, de beskårne billeder blev først roteret baseret på fartøjstype for groft at justere fartøjets akse med å-retningen i en billedstabel, og kanalen på det fluorescerende mosaikcellemærke blev valgt til projektion. For at overvinde problemer med automatiseret fartøjssegmentering i blodpuljens fluorescenskanal forårsaget af variable fluorescerende baggrundsstrukturer og perfusion af dekstran-rhodamin uden for fartøjet, fartøjets akse blev identificeret ved manuelt at definere fartøjets position ca.hver 10 liter gennem billedstakken og derefter udføre en Catmull-Rom spline pasform og interpolation. Dataene blev derefter transformeret for at rette fartøjets akse i tre dimensioner. Dernæst blev positionen af maksimal intensitet i projektionskanalen identificeret langs stråler med 1 liter intervaller omkring fartøjets akse. Denne information blev brugt til at projicere fluorescensintensitet på et plan, hvor akser er position langs fartøjets akse og vinkelposition, og at kortlægge afstanden fra fartøjets akse ved hver position på det projicerede plan. Cellen blev identificeret fra det projicerede billede ved hjælp af Imagejs indbyggede Intermodes-metode. Buelængderne repræsenteret af siderne af hvert punktpunkt forbundet med cellen blev derefter beregnet (\(l = \frac{{2 \ pi rd^2}}{{360}}\), hvor r er afstanden mellem celleassocieret punktpunkt og fartøjets akse, og d er siden af et punktpunkt) og bruges til at generere målinger af celleoverfladeareal og billedformat.
in vitro celleformanalyse: faste Huvec ‘ er blev afbildet med et Olympus UPLSAPO 40 liter/NA 1.25 silicone oil immersion mål. I alt blev 10-20 billeder fra hver cover slip taget til kvantificering og analyseret på en semi-automatiseret måde ved hjælp af et specialskrevet ImageJ-script. Flerkanals-stakke blev maksimalt projiceret, og kanalen, der viste en GFP-markør, blev identificeret ud fra instrumentmetadata. Imagejs indbyggede Otsu-tærskemetode blev brugt til at adskille celler af interesse fra baggrunden; resulterende binære billeder blev renset ved at fjerne regioner mindre end 105 liter 2 og regioner i kontakt med synsfeltets grænse. Et efterfølgende manuelt interventionstrin gjorde det muligt for brugeren valgfrit at ændre celleområder af interesse baseret på dette binære billede for at adskille fejlagtigt flettede celler eller inkludere celler, der blev savnet af tærskeloperationen. Scriptet derefter beregnet områder og perimetre for hver celle ROI. Derudover blev der beregnet et ‘spikiness-indeks’ for hver celle baseret på forholdet mellem celleperimeteren og omkredsen af det tilsvarende konvekse skrog, og en værdi for billedformatet for cellen blev beregnet som forholdet mellem de store og mindre akser af en ellipse monteret på cellens ROI.
analyse af membranblebbing: Plots vedrørende membranblebbing blev genereret på en semi-automatiseret måde ved hjælp af et specialskrevet ImageJ-script. For hver afbildet membran blev forholdet mellem konturlængden af en membrankant og den euklidiske afstand mellem kantendepunkterne beregnet på hvert tidspunkt. Fra den resulterende tidsserie blev effektspektral densiteter beregnet ved hjælp af Vechs metode51. Effektspektraltætheden blev derefter gennemsnitligt over et vindue af interesse, defineret empirisk som den karakteristiske tid, over hvilken blebs dannede sig (0,04–0,06 HS); disse gennemsnitlige værdier blev sammenlignet mellem eksperimentel (Marksl1b overekspression) og kontrolbetingelser.
analyse af actin og myosin II dynamik i blebs: Plots vedrørende dynamikken i actin eller myosin i blebbing celler blev genereret i en semi-automatiseret måde ved hjælp af en custom-skrevet ImageJ script. Multichannel time-lapse-stakke blev først maksimalt projiceret langs å-dimensionen. Programmet identificerede derefter automatisk kanten af en bleb mellem to brugerdefinerede ankerpunkter på alle tidspunkter ved hjælp af Imagejs indbyggede Otsu-tærskelmetode, der kører på Marksl1b-EGFP-kanalen som et surrogat til membranmærkning. Efter et brugerkvalitetskontroltrin for at sikre nøjagtig identifikation af bleb edge blev actin/myosin-kanalintensitetsprofilen langs kanten ekstraheret på hvert tidspunkt og afbildet mod tiden i en kymograf. På hvert tidspunkt blev intensitetsstatistikker ekstraheret sammen med bleb-området, defineret her som det projicerede område omgivet af kanten og linjen, der forbinder punkterne på hver side af bleb længst fra bleb-spidsen langs en akse vinkelret på linjen, der forbinder de brugerdefinerede ankerpunkter, og gennemsnitlig actin/myosin-kanalintensitet og bleb-område blev afbildet mod tiden.
kvantificering af kortikal actindensitet og bundtbredde: Billeder i høj opløsning af actin i HUVECs blev erhvervet ved hjælp af et Plan-APOCHROMAT 63-oliemålslinse monteret på et konfokalt mikroskop udstyret med en Airyscan og GaAsP-detektor. Rundt regnet 3 liter kvadrerede regioner inden for hver observation blev tilfældigt udvalgt og beskåret typisk 8 optiske sektioner, der dækker det kortikale netværk ud af disse regioner. Projicerede billeder langs å-aksen af beskårne stakke blev genereret ved maksimal intensitetsprojektion og underkastet følgende procedure. Da actinfilamenter i billedet var tvetydige, og det var umuligt at evaluere hele netværket, vi kvantificerede antallet af actinfilamenter inden for de begrænsede regioner som tætheden af actinnetværksarbejde. Dette blev udført ved at indstille scanningslinjer langs H – og Y – akser ved hver 4 billedpunkter, og billedværdier langs hver scanningslinje blev underkastet Savitsky-Golay filter52 for at beregne de første ordens derivater. Actinfilamenter blev derefter identificeret ved at finde nulkrydsningspunkter, som er intensitetstopperne på scanningslinjen. Tællinger for toppe blev divideret med billedtællingerne for scanningslinjen (bredde eller højde på billedet), og filamenternes tæthed over billedet blev beregnet ved at tage gennemsnittet af disse værdier.
for at kvantificere actinbundtbredden blev de centrerede linjer i actinbundterne genereret ved at finde nulkrydsningspunkter for førsteordensderivater beregnet af filteret Savitsky-Golay og efterfulgt af anvendelse af hilditch-udtyndingsalgoritmen. For at eliminere en mulighed for, at forgrenings – eller krydspunkter af actinfilamenterne påvirker målingerne, blev forgreningspunkter fundet inden for den skeleterede linje elimineret og segmenteret. Den ortogonale akse til det samlede segment blev bestemt ved at opnå egenvektoren, og fluorescerende intensiteter blev udtaget langs den ortogonale akse, der kørte segmentets tyngdepunkt med Lancsos-5 interpolationsmetode. Derefter blev diameteren af et filament bestemt af bredden af regionen, der viste større eller lig med halvdelen af topintensiteten inden for den linje, der blev udtaget langs den ortogonale akse til det samlede segment.
statistik: statistisk analyse blev udført ved hjælp af Prism 8.). Prøvestørrelser var ikke forudbestemt, eksperimenterne blev ikke randomiseret, og efterforskere blev ikke blindet for tildeling under eksperimenter og resultatvurdering.
Rapporteringsoversigt
yderligere information om forskningsdesign findes i Nature Research Reporting Resume, der er knyttet til denne artikel.
