oprensning og karakterisering af Asparaginase fra Phaseolus vulgaris frø

abstrakt

L-asparaginase fra bakterier er blevet anvendt til behandling af akut lymfoblastisk leukæmi. Formålet med denne undersøgelse var at rense og karakterisere L-asparaginase fra Phaseolus vulgaris frø i stedet for mikrobielle kilder. L-asparaginase blev oprenset til tilsyneladende homogenitet. En molekylær masse på 79 kDa. Den oprensede asparaginase havde meget lav aktivitet over for et antal asparagin-og glutaminanaloger. L-asparaginase var fri for glutaminaseaktivitet. Det blev fundet, at kinetiske parametre, Km og Vmaks, var henholdsvis 6,72 mm og 0,16 liter. PH-værdien var optimal ved 8,0. 7,5–9,0), når den blev inkuberet i op til 24 timer. L-asparaginase havde den samme temperaturoptimale og termiske stabilitet ved 37 liter C. K+ var i stand til i høj grad at forbedre aktiviteten af asparaginase med 150% sammenlignet med andre testede metaller. Afslutningsvis viste L-asparaginase ingen glutaminaseaktivitet og god stabilitet over en lang række fysiologiske tilstande, og det kunne således bruges som en potentiel kandidat til behandling af akut lymfoblastisk leukæmi.

1. Introduktion

L-asparaginase (L-asparagin amidohydrolase E. C. 3.5.1.1) anvendes til behandling af akut lymfoblastisk leukæmi og ikke-Hodgkins lymfom . Anvendelsen af L-asparaginase i kræftbehandling er baseret på dets evne til at spalte L-asparagin, en aminosyre, der er essentiel for lymfoblasternes vækst, til ammoniak og L-asparaginsyre i serum og cerebrospinalvæske, da lymfoblaster ikke er i stand til at producere endogent L-asparagin, hvilket fører til død af disse celler . De fleste af kræftcellerne er afhængige af en eksogen kilde til denne aminosyre for overlevelse. Imidlertid er normale celler i stand til at syntetisere L-asparagin og påvirkes således mindre af dets hurtige udtømning på grund af behandling med dette. L-asparaginase kan også bruges til at reducere dannelsen af acrylamid i stegte og ovnkogte fødevarer, især i kartoffelchips . Dannelsen af acrylamid blev tilskrevet reaktionen af frit asparagin og reducerende sukkerarter . Udtømningen af asparagin med asparaginase forhindrede dannelse af acrylamid .

L-asparaginase er bredt fordelt blandt planter, dyr og mikroorganismer . I planten blev dette først påvist i de udviklende frø af Lupinus albus . Asparaginase er også blevet oprenset fra testa af modne frø af L. polyphyllus . Der er identificeret to former. En k + – uafhængig form findes i L. arboreus og L. polyphyllus, og en K+-afhængig form findes i Pisum sativum og flere andre bælgplanter, herunder andre Lupinus-arter . Arbejde med antistoffer mod K+-uafhængig form fra L. polyphyllus afslørede ingen krydsreaktion med hverken ært asparaginase eller et antal sorter af Lupinus indeholdende K+-afhængig, hvilket antyder, at de to former for asparaginase er immunologisk forskellige .

der er rapporteret meget lidt information om anvendelse af plante asparaginase til behandling af akut lymfoblastisk leukæmi . Derfor var hovedmålet med denne undersøgelse at rense og karakterisere L-asparaginase fra Phaseolus vulgaris frø fri for L-glutaminase i stedet for L-asparaginase fra mikrobielle kilder, der anvendes som anticancer og forårsagede bivirkninger på grund af dets immunologiske reaktioner.

2. Materiale og metoder

2.1. Plantematerialer

modne frø fra Phaseolus vulgaris cv. Disa 6 blev hentet fra Agricultural Research Center, Kairo, Egypten.

2.2. Rensning af Asparaginase

2.2.1. Råekstrakt

det rå ekstrakt af asparaginase blev fremstillet ved homogenisering af 50 g frø fra Phaseolus vulgaris cv. 6 i 20 mM Tris-HCl-buffer, pH 8,0 indeholdende 10% glycerol, 50 mM KCl, 12,5 mm liter-mercaptoethanol og 1 mM PMSF. Homogenatet blev centrifugeret ved 10.000 liter g, og supernatanten blev betegnet som råekstrakt. Råekstraktet blev koncentreret ved dialyse mod fast saccharose.

2.2.2. DEAE-Sepharosesøjle

koncentreret råekstrakt blev påført på en DEAE-Sepharosesøjle (15 g 1,6 cm i.D.), som tidligere var ækvilibreret med 20 mM Tris-HCl-buffer, pH 8,0. Ved forskellige koncentrationer af KCl fremstillet i den samme buffer ved en strømningshastighed på 60 mL/time og 3 mL fraktioner blev opsamlet. Tre toppe af protein blev elueret med asparaginaseaktivitet i henhold til elueringsrækkefølgen (asparaginaser i, II og III).

2.2.3. Sephacryl S-200

Asparaginase i med højeste aktivitet blev påført på en Sephacryl S-200-kolonne (90 liter 0.6 cm i.D.), som tidligere var ækvilibreret med den samme buffer ved en strømningshastighed på 30 mL/time og 3 mL fraktioner blev opsamlet.

2.3. Asparaginaseanalyse

aktiviteten af L-asparaginase blev målt ved modificeret Vridningsmetode . L-asparaginasen katalyserer L-asparagin til L-asparaginsyre og ammoniak, og sidstnævnte reagerer med Nesslers reagens for at producere et orangefarvet produkt. 900 liter frisklavet l-asparagin (20 mM) i 50 mM Tris-HCl-buffer (pH 8,0), 50 mM KCl og 100 liter råekstrakt. Reaktionsblandingen blev inkuberet ved 37 liter C i 30 minutter, og reaktionen blev stoppet ved tilsætning af 100 liter 15% trichloreddikesyre. Reaktionsblandingen blev centrifugeret ved 10.000 liter g i 5 minutter ved 4 liter C for at fjerne bundfaldene. Ammoniakken frigivet i supernatanten blev bestemt ved anvendelse af kolorimetrisk teknik ved at tilsætte 100 liter nesslers reagens i prøven indeholdende 100 liter supernatant og 800 liter destilleret vand. Indholdet i prøven blev hvirvlet og inkuberet ved stuetemperatur i 10 minutter, og OD blev målt ved 425 nm. Ammoniakken produceret i reaktionen blev bestemt ud fra standardkurven opnået med ammoniumsulfat. En enhed af L-asparaginaseaktivitet defineres som mængden af ammoniak, der frigiver 1 liter ammoniak pr. minut ved 37 liter C.

2,4. Proteinbestemmelse

Protein blev kvantificeret ved metoden af Bradford med bovint serumalbumin som standard.

2.5. Molekylvægtbestemmelse

den native molekylvægt blev bestemt af Sephacryl S-200. Søjlen blev kalibreret med cytochrom C (12.400), kulsyreanhydrase (29.000), bovint serumalbumin (67.000), alkoholdehydrogenase (150.000) og LARP-amylase (200.000). Dekstran blå (2.000.000) blev brugt til at bestemme void volume (Vo). Underenhedens molekylvægt blev estimeret ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese . SDS – denatureret phosphorylase b (94.000), bovint serumalbumin (67.000), ovalbumin (43.000), kulsyreanhydrase (30.000), sojabønnetrypsininhibitor (20.000) og kurvlactalbumin (14.200) blev anvendt til kalibreringskurven.

2.6. Karakterisering af Asparaginase

2.6.1. Substratspecificitet

Asparaginaseaktivitet blev bestemt med nogle analoger af L-asparagin. Den relative aktivitet blev udtrykt som procentdelen af aktiviteten bestemt mod forskellige strukturanaloger af L-asparagin til aktiviteten med L-asparagin.

2.6.2. Kinetiske parametre

værdierne af Michaelis-konstanter (Km) og maksimal hastighed (Vmaks) blev bestemt ved anvendelse af L-asparagin som substrat i området 2-20 mM. kinetiske parametre blev bestemt ud fra Linjevævburk-plot.

2.6.3. Effekt af pH

den optimale pH for asparaginaseaktiviteten blev bestemt ved at analysere aktiviteten ved forskellige pH-værdier. Ph-stabiliteten blev testet ved inkubation ved pH på 5,0–9,0 i 24 timer ved 4 kg C i fravær af substrat, og restaktivitet blev bestemt under standardanalysebetingelserne.

2.6.4. Effekt af temperatur

den optimale temperatur for asparaginaseaktivitet blev bestemt ved at analysere temperaturen ved forskellige temperaturer. Varmestabilitet blev målt ved at inkubere stoffet alene ved forskellige temperaturer i 1 time.efter varmebehandling blev opløsningen afkølet, og restaktiviteten blev analyseret efter tilsætning af substraterne.

2.6.5. Metalioneffekt

virkningerne af forskellige metalioner på aktiviteten blev bestemt ved præinkubering af metalionerne alene med 10 mM metalioner i 15 minutter før tilsætning af substratet. Aktiviteten, der blev analyseret i fravær af metalioner, blev taget som 100%.

3. Resultater og diskussion

resultaterne af oprensningstrin for asparaginase fra P. vulgaris er opsummeret i tabel 1. Elueringsprofilen for kromatografien på DEAE-Sepharose-kolonnen (Figur 1) viste tre toppe af proteiner med asparaginaseaktivitet. Peak one med den højeste asparaginaseaktivitet blev påført på en Sephacryl S-200 kolonne (figur 2). L-asparaginase I blev oprenset 21,7 gange med en specifik aktivitet på 846 enheder/mg protein. Asparaginase I viste sig at være ren efter sefacryl S-200 kolonne som vurderet af SDS-PAGE (figur 3). Molekylvægten af asparaginase I ved Sephacryl S-200 og SDS-SIDEPROCEDURER gav en værdi på 79 kDa som monomerunderenhed. Dette fund er i overensstemmelse med molekylvægten for asparaginaser fra Vigna unguiculata (70 kDa) og Lupinus polyphyllus (75 kDa) . En medium molekylvægt på 58 kDa blev påvist for asparaginase fra ærteblade . For bakterielle asparaginaser varierede molekylvægten fra 140 til 160 kDa med tetramer-underenheder . En meget lav molekylvægt på 11,2 kDa blev påvist for Streptobacillus sp. Kk2s4 asparaginase .

Figur 1

en typisk elueringsprofil for kromatografi af asparaginase fra P. vulgaris på DEAE-Sepharose kolonne (15 til 1,6 cm i.d.) tidligere ækvilibreret med 20 mM Tris-HCl-buffer, pH 8,0 ved en strømningshastighed på 60 mL/time og 3 mL fraktioner.

figur 2

gelfiltrering af asparaginase i fra DEAE-Sepharosefraktion på Sephacryl S-200 kolonne (90 til 1,6 cm i.d.). Søjlen blev ækvilibreret med 20 mM Tris-HCl-buffer, pH 8,0 ved en strømningshastighed på 30 mL/time og 3 mL fraktioner.

figur 3

SDS-side for homogenitet og molekylvægt bestemmelse af asparaginase i fra Phaseolus vulgaris. (1) proteinmarkører; (2) Sephacryl S-200 asparaginase I.

substratspecificiteten af asparaginase I er blevet undersøgt ved anvendelse af et antal asparagin-og glutaminanaloger (tabel 2). Aktiviteten med L-asparagin blev betragtet som 100% aktivitet. Dl-asparagin udviste 30% af aktiviteten, hvor dl-asparagin er sammensat af en 1 : 1 racemisk blanding. D-asparagin, L-asparaginsyre og L-glutaminsyreanaloger havde meget lav aktivitet over for asparaginase I. Der blev ikke påvist nogen aktivitet i nærvær af L-glutamin. Derfor er asparaginase i fra P. vulgaris fri for glutaminase. Forureningen af asparaginase med glutaminaseaktivitet forårsagede bivirkninger i løbet af kræftbehandling . L. arboreus asparaginase hydrolyserede kun l-asparagin og DL-aspartylhydroksamat . V. unguiculata asparaginase var specifik for L-asparagin, hydrolyserede ikke D-asparagin og var ikke specifik for L-glutamin .

det blev konstateret, at kinetiske parametre, Km og Vmaks, var henholdsvis 6,72 mM asparagin og 0,16 liter ammoniak/mL (figur 4). Tilsvarende Km-værdier på 6,6 og 7,0 mM blev bestemt for asparaginaser fra henholdsvis L. arboreus og L. angustifolius . Asparaginase fra Lupinus frø har høj Km for asparagin (12,2 mM) . Lav Km (1.2 mM) blev bestemt for asparaginase fra V. unguiculata . For bakterier var Km-værdierne for L-asparaginase fra Escherichia coli og Ervinia carotovora henholdsvis 3,5 mM og 7,14 mM .

figur 4

Line-Burk plot vedrørende asparaginase i fra P. vulgaris hastigheder til forskellige L-asparagin koncentrationer.

Asparaginase i udviste ph optimal ved 8,0 (figur 5). Mellem pH 6,0 og 9,0 blev mere end 50% af dets aktivitet bevaret. Selvom maksimal aktivitet ved fysiologisk pH er en af forudsætningerne for L-asparaginase for antitumoraktivitet, ville det rensede ferment være nyttigt, fordi 80% af fermentaktiviteten blev bibeholdt ved pH 7,5. 7,5–9,0), da den bevarede 90% af sin oprindelige aktivitet, når den blev inkuberet op til 24 timer (figur 6). Imidlertid varierede pH-optimumet for L-asparaginaser fra flere planter fra 8,0 til 8,5 . De fleste af L–asparaginaser fra bakterier viste alkalisk pH optima (8,0-10) .

figur 5

ph optimal af asparaginase i fra P. vulgaris. Aktiviteten blev målt ved forskellige pH ‘ er ved hjælp af standardanalysemetoden som tidligere beskrevet.

figur 6

pH-stabilitet af asparaginase i fra P. vulgaris ved forskellig pH efter inkubation i 24 timer ved 4 liter C.

Asparaginase I viste sig at have optimal temperatur ved 37 liter C (Figur 7). Tilsvarende temperaturoptimal for asparaginase fra V. unguiculata (40 liter C) blev rapporteret . Denne temperatur svarede også til den, der blev rapporteret for Pseudomonas aeruginosa og Pectobacterium carotovorum . Den optimale aktivitet af Streptobacillus sp. asparaginase blev registreret ved 35 C . Tværtimod blev L-asparaginase fra Chrombacteriaceae og Proteus vulgaris observeret ved henholdsvis 20 og 57 . Der blev påvist en ikke-lineær sammenhæng mellem asparaginase i og temperaturstabilitet (figur 8). Aktiviteten var stabil op til 37 liter C efter inkubation i 1 time. Asparaginase fra V. unguiculata var stabil op til 40 liter C efter inkubation i 15 minutter . Asparaginaser fra P. carotovorum og C. annuum beholdt deres oprindelige aktivitet efter inkubation ved henholdsvis 40 kvik C og 45 kvik C i 60 minutter .

Figur 7

temperatur optimal af asparaginase i fra P. vulgaris. Aktiviteten blev målt ved forskellige temperaturer ved anvendelse af standardanalysemetoden som tidligere beskrevet.

figur 8

termisk stabilitet af asparaginase i fra P. vulgaris. Reaktionsblandingen blev præinkuberet ved forskellige temperaturer i 60 minutter før substrattilsætning, efterfulgt af afkøling i et isbad. Aktiviteten blev målt ved hjælp af standardanalysemetoden som tidligere beskrevet. Aktivitet på nul tid blev taget som 100% aktivitet.

virkningen af forskellige metalioner på asparaginase I blev undersøgt (tabel 3). Metalionerne blev anvendt i en koncentration på 10 mM. k+ var i stand til i høj grad at forøge aktiviteten af asparaginase i med 150%. I Plante var K+-uafhængige og K+-afhængige asparaginaser blevet identificeret . K + fungerede også som forstærker på P. carotovorum asparaginase . Ca2 + forbedrede aktiviteten lidt med 110%, men Cu2+ hæmmede aktiviteten af asparaginase I. derudover forårsagede Pb2+ og Hg2+ delvist hæmmende virkning på asparaginase I. V. unguiculata asparaginase blev imidlertid aktiveret af Ni2+ og Co2+ og blev hæmmet af Mn2+, TN2+, Ba2+ og Hg2+ . EDTA som metalchelatormiddel forårsagede delvist hæmmende virkning på asparaginase I. EDTA havde imidlertid ingen effekt på P. carotovorum asparaginase .

4. Konklusioner

L-asparaginase i fra P. vulgaris blev oprenset i glutaminasefri form, hvilket kan reducere muligheden for bivirkninger i løbet af kræftbehandling. Det viste god stabilitet over en lang række fysiologiske forhold som pH og temperatur. I det næste trin i vores projekt vil L-asparaginase i fra P. vulgaris blive brugt som en potentiel kandidat til behandling af akut lymfoblastisk leukæmi.

interessekonflikt

forfatterne har ingen interessekonflikt, der er relevant for dette papir at afsløre.

anerkendelser

dette projekt blev finansieret af den nationale Plan for Videnskab, Teknologi og Innovation (MAARIFAH), Kong Abdulas by for videnskab og teknologi, Saudi-Arabien, pris nr. (11-BIO-1516-03). Forfatterne anerkender også med tak videnskab og teknologi enhed, King Abdulas Universitet, for teknisk support.