patienter med intoleransreaktioner på Total knæudskiftning: kombineret vurdering af Allergidiagnostik, Periprostetisk histologi og Peri-implantat Cytokinekspressionsmønster

abstrakt

vi udførte en kombineret tilgang til at identificere mistanke om allergi over for knæartroplastik (TKR): patch test (PT), lymfocyttransformationstest (LTT), histopatologi (samlet klassificering af; T-og B-lymfocytter, makrofager og neutrofiler) og semikvantitativ realtids-PCR-baseret periprostetisk inflammatorisk mediatoranalyse (IFNy, TNFa, IL1-Larsen, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL17 og TGF-Karsten). Vi analyserede 25 TKR-patienter med endnu uforklarlige komplikationer som smerte, effusion og reduceret bevægelsesområde. De bestod af 20 patienter med påvist metalsensibilisering (11 med PT-reaktioner; 9 med kun LTT-reaktivitet). Kontrolprøver var fra 5 komplicerede TKR-patienter uden metalsensibilisering, 12 OA-patienter før artroplastik og 8 PT-patienter uden artroplastik. Lymfocytiske infiltrater blev set, og fibrotisk (type IV-membran) vævsrespons var hyppigst hos de metalfølsomme patienter, for eksempel hos 81% af de PT-positive patienter. Sidstnævnte havde også markeret periprostetisk IFNy-udtryk. 8/9 patienter med revisionskirurgi ved hjælp af ti-coatede/oksiniumbaserede implantater rapporterede symptomlindring. Vores fund viser, at kombination af allergidiagnostik med histopatologi og periprostetisk cytokinvurdering kunne give os mulighed for at designe bedre diagnostiske strategier.

1. Introduktion

udskiftning af hofte og knæ er meget vellykkede kirurgiske procedurer for at genoprette livskvaliteten hos patienter med slidgigt, og tilsvarende implantationshastigheder stiger støt . Imidlertid fører implantatfejl i en væsentlig del af sådanne patienter til implantatrevision. En nylig gennemgang viser en samlet knæudskiftningsrevision (TKR) på 9, 5% i Tyskland og på 8, 4% i USA for året 2011 . Inden for spektret af tilstande, der fører til TKR-svigt, kan der findes bivirkninger, men allergiens rolle er stadig et kontroversielt spørgsmål. Kutan metalallergi er hyppig i den generelle befolkning, for eksempel cirka 13% til nikkel (Ni), 2% til kobolt (Co) og 1% til krom (Cr) . Enten slid eller korrosion fører til Peri-implantat og systemisk metal (især Ni, Cr eller Co) eksponering af artroplastiske patienter, og tilsvarende rapporteres forekomsten af metalfølsomhed hos patienter med mislykket implantat at være øget . Med hensyn til total hofteudskiftning blev aseptisk løsnelse for det meste tilskrevet slidassocieret makrofag domineret fremmedlegemsrespons som underliggende mekanisme . I løbet af det sidste årti har opmærksomheden henvendt sig til overfølsomhedens rolle i peri-implantatbetændelse. Især i Metal-på-metal artroplastik blev en undergruppe af patienter beskrevet, der viste temmelig Peri-implantat lymfocytisk inflammation som potentiel fremkaldelse af implantatsvigt . Beskrevne histologiske ændringer inkluderer diffus, perivaskulær eller lymfefollikel (lymfoid) som infiltration af lymfocytter og få makrofager, høje endotelvenuler og delvis vævsnekrose . Metalallergi som en medvirkende faktor blev foreslået af den observerede sammenhæng mellem Peri-implantat lymfocytisk inflammation, patch test reaktivitet over for metaller og forbedret lymfocyttransformationstest (LTT) respons på metaller i en række sådanne patienter . Der er dog stadig kontroversiel diskussion om, i hvilket omfang metalallergi bidrager til “paraplybetegnelsen” bivirkninger ved hofteartroplastik . Faktisk kan metalallergiske patienter godt tolerere de respektive metaller, der indeholder implantat . Med hensyn til TKR findes der også rapporter om kutan metalallergi fundet i forbindelse med komplikationer , men det undersøges endnu ikke nærmere, om en sådan metalallergi er ansvarlig for den biologiske reaktion. Da vi ser patienter med mistanke om implantatintoleransreaktioner i en speciel ambulant ambulant, spekulerede vi på, om i en række patienter med kompliceret TKR en potentiel metalfølsomhed kunne knyttes til et bestemt Peri-implantat histologisk billede og cytokinekspressionsmønster. For at tackle den potentielle kliniske relevans af resultaterne kontaktede vi yderligere patienterne for at se, om de har haft en vis fordel ved revisionskirurgi med særlig opmærksomhed på den potentielle anvendelse af “hypoallergeniske” materialer ved revisionskirurgi.

formålet med undersøgelsen var således bedre at bevise allergisk etiologi i kompliceret TKR ved at kombinere forskellige diagnostiske trin og ved at vurdere den kliniske relevans af fundene i en opfølgning.

2. Materialer og metoder

2.1. Patienter og kontroller

i alt 45 patienter deltog i undersøgelsen. Undersøgelsen blev godkendt af det etiske udvalg. Følgende patientgrupper blev analyseret.

25 knæartroplastiske patienter (16 m, 9 f, 37-75 år) med CoCrMo-baseret TKR og komplikationer som løsnelse, tilbagevendende effusioner og smerter blev præsenteret af deres behandlende ortopædkirurger for vores ambulante til allergidiagnostik, da forudgående diagnostik ikke gav nogen indikation af problemudløsere som malpositionering/forkert justering, brud eller infektion. Ifølge resultaterne af allergidiagnostik blev disse patienter yderligere tildelt tre grupper. Gruppe I: 11 patienter (patch-test positiv og LTT-positiv), gruppe II: 9 patienter (patch-test negativ og LTT-positiv) og Gruppe III: 5 patienter (patch-test negativ og LTT-negativ).

undersøgelsen omfattede 12 patienter (1 m, 52-89 år; “OA-kontrolgruppe”) uden implantat, men degenerativ ledsygdom/slidgigt (OA) før knæartroplastik.

undersøgelsen omfattede 8 patienter (2 m, 53-75 år; “PT-kontrolgruppe”) uden implantat, men efter at have gennemgået patch test (PT) for mistanke om allergiske hudsygdomme. 6/8 havde Ni-PT reaktivitet, 2/8 havde ingen Ni-PT reaktivitet.

hos de 25 TKR-patienter blev potentiel metalfølsomhed vurderet af PT og LTT; desuden blev periprostetiske vævsprøver opnået til histologi, molekylær analyse og mikrobiologi. Derudover blev der opnået en kvindelig score ved det ambulante besøg for at få feedback på patienternes opfattelse af dagliglivsaktivitet og smerte. Hos de 12 OA-patienter (“OA-kontrolgruppe”) blev der ved primær TKR opnået vævsprøver til histologi, molekylær analyse og mikrobiologi. I de 8″ PT-kontrolgruppe ” – patienter blev biopsier opnået fra de 6 ni-PT reaktive og de 2 Ni-ikke-reaktive PT-områder til histologi og molekylær analyse. Karakteristika for de 45 patienter er opsummeret i tabel 1.

2.2. Patch Test (PT)

hos de 25 TKR-patienter blev en europæisk standardserie på 30 kontaktallergener inklusive et Co, et Cr og et ni-præparat (Hermal, Reinbek, Tyskland) suppleret med en metalallergen-serie (Brial Allergen GmbH, Greven, Tyskland) samt en knoglecementkomponentserie i tilfælde af cementeret artroplastik testet på patienternes ryg. Testpræparater blev anvendt i Finn chambers i 2 dage, og reaktionerne blev evalueret på dagen for fjernelse og 3 dage efter påføring. Hos patienter med test af knoglecementserier blev der udført en yderligere læsning efter 1 uge. Klassificering af hudreaktionerne var som anbefalet af den tyske kontaktdermatitis-forskningsgruppe.

2.3. Lymfocyttransformationstest (LTT)

mononukleære celler i perifert blod (PBMC) blev opnået fra det hepariniserede blod fra TKR-patienterne ved tæthedscentrifugering på Ficoll-Hypak (Phadia, Freiburg, Tyskland). Celler blev dyrket i rpmi1640 medium (Biochrom, Berlin, Tyskland) suppleret med autologt serum, glutamin, antibiotikum-antimykotisk opløsning og ikke-essentielle aminosyrer. Alle kulturer blev udført i firdobbelt i 96-brøndsplader (Nunc, Roskilde, Danmark). Stimuli var Pan T-celle mitogen phytohemagglutinin (PHA) 2,4 liter/mL, tetanustoksoid (TT ) 5 liter/mL, NiSO4, CrCl3 og CoCl2 (7 koncentrationer hver fra til) og dyrkningsmedium alene som kontrol. Efter 5 dage blev celler pulseret med 3H thymidin natten over, og proliferation blev vurderet ved inkorporeret radioaktivitet. Stimuleringsindekset (SI) blev beregnet ved forholdet mellem gennemsnitlige tællinger pr. SI > 3 blev betragtet som positiv.

2.4. Analyse af peri-Implantatvæv

hos de 25 TKR-patienter blev vævsprøver opnået fra den nydannede artikulære kapsel på revisionstidspunktet. Mindst 2 prober blev sendt til mikrobiologisk evaluering til Endoklinik Hamburg. De to andre prober blev behandlet til histologi og en probe til molekylær analyse. I de 12 OA-patienter blev vævsprøver opnået på tidspunktet for primær artroplastikimplantation til histologi og molekylær analyse som ovenfor. De 8″ PT-kontrolgruppe ” patienter gennemgik punchbiopsi af deres Ni-PT-områder på bagsiden efter testaflæsning på D3. En sonde hver blev opnået til histologi og molekylær analyse.

2.5. Histologisk undersøgelse

det formalinfaste væv blev behandlet og farvet med hæmatoksylin-eosin. Immunhistologi blev udført med antistoffer mod T-celle (CD3), B-celle (CD20), makrofag (CD68 resp KP1) og neutrofile (CD15) antigener. Sektionerne blev undersøgt mikroskopisk, og den forholdsmæssige fordeling af vævskomponenterne inklusive makrofager, diffus eller perivaskulær akkumulering af T – eller B-lymfocytter og plasmaceller såvel som det samlede reaktionsmønster for vævsprøven blev semikvantitativt vurderet. Klassificeringsresultatet var ifølge Krenn et al. og i tilfælde af TKR-patientafledte prøver blev konsensusklassifikationen anvendt. Denne konsensusklassificering opdeler peri-implantatvævsreaktionsmønstre i en partikeldomineret fremmedlegeme som respons (Type i), en granulocytdomineret infektiøs type (Type II), blandingen af type i og II (kombineret Type, Type III) og en paucicellulær og temmelig fibrotisk reaktion (type IV, ligeglad type).

2.6. Molekylær analyse

følgende prober blev opnået i RNA-konserverende væske til efterfølgende analyse: fra hver af de 25 TKR-patienter og 12 OA-kontrolpatienter peri-implantat og subkutant væv (reference) probe; fra patch test kontrolgruppe 6 Ni-PT-positive prober og 2 prober fra Ni-ikke-reaktivt teststed (reference).

Total RNA blev isoleret fra vævsprøven ved phenol/chloroformekstraktion og revers transkriberet til cDNA ved anvendelse af AMV revers transkriptase. Ekspressionen af følgende cytokiner blev analyseret ved hjælp af semikvantitativ RT-PCR i LightCycler: IFNy, TNF, IL1-kur, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL17 og TGF kur. Ekspressionsværdien blev bestemt i sammenligning med husholdelsesgenet EF1-ved hjælp af Kript – metoden af schmittgen og livak .

2.7. Sammenligning af præ-og postoperativ Kvindelig Score

et modificeret score-system er blevet brugt i overensstemmelse med offentliggørelsen af Roos et al. . Fra gruppe i og II patienter præoperativ kvinder knæ score var tilgængelig, Vi kontaktede yderligere patienter efter revisionskirurgi for også at få (ikke mindre end 6 måneder efter operationen) deres postoperative kvinder score information. Der blev lagt særlig vægt på patienter med revision ved brug af “hypoallergenisk” materiale.

3. Resultater og diskussion

Metalimplantatallergi er stadig en diagnose af udelukkelse med en forsinkelse i diagnosen på grund af manglende sygdomsspecifikke kriterier og behov for at kombinere forskellige diagnostiske trin. Således stilles forskellige komplikationsudløsere først spørgsmålstegn ved TKR-svigt, og metalimplantatallergi diagnosticeres ved en kombination af PT, LTT, og histopatologi . Undersøgelsen præsenteret her sigter mod at understøtte forbedring af diagnostiske værktøjer.

3.1. Allergi diagnostik

inden for de 20 patienter med metalfølsomhed viste 11 (Gruppe I) PT-reaktioner på metaller (delvis flere reaktioner): 10 til Ni, 6 til Co, 2 til Cr, og en af disse 11 patienter viste også PT-reaktioner på knoglecementkomponenter (til gentamicin og bensoyloverilte). I 6/11 var yderligere LTT-data tilgængelige og viste 5 gange ni-reaktivitet og 1 ikke-reaktiv LTT. I de resterende 9 patienter (gruppe II) med negativ PT til implantatkomponenter, men positiv LTT fandt vi 9 gange LTT-reaktivitet over for Ni, 1 gange til Co. Disse data er opsummeret i tabel 2-4. I flere undersøgelser er der fundet øget metalfølsomhed hos patienter med artroplastik . I større skala, når man sammenligner 100 symptomfri til 200 komplicerede artroplastiske patienter, kunne en sådan øget forekomst af metalallergi-især til Ni—reproduceres . De fleste data om in vivo metalfrigivelsesbetingelser er afledt af hofteartroplastiske patienter. Lokal co-og CR-frigivelse ses dog også ved TKR, og respektive systemiske eksponering af patienterne rapporteres . Desuden kan der også observeres betydelig ni-frigivelse hos patienter med CoCrMo-artroplastik . Overvejelsen af Ni-allergi i vores patientgrupper kan således ikke kun afspejle relativ overvægt af Ni-allergi i den generelle befolkning. På den anden side kan selv symptomfrie patienter med godt udført knæartroplastik have kutan metalallergi over for implantatlegeringsmetaller . Således som Granchi et al. erklærede i 2012, at tilstedeværelsen af metalfølsomhed muligvis ikke betyder implantatfejlmekanisme på enkelt patientniveau.

3.2. Histologisk undersøgelse

vi spekulerede derefter på, om den periprostetiske vævsanalyse ville hjælpe med at diskriminere hyperergisk vævsrespons. Til dette formål blev fire betingelser valgt til sammenlignende analyse af vævsprøve. For eksempel blev periprostetiske vævsprøver opnået fra (1) de 20 TKR-patienter med komplikationer og metalfølsomhed (gruppe I og II); (2) de 5 TKR-patienter med komplikationer, men ingen metalfølsomhed (Gruppe III); (3) 12 patienter med degenerativ knæledssygdom / slidgigt (OA-kontrolgruppe) ved primær artroplastik; og (4) de kutane biopsier, der blev udført på PT-steder hos 8 PT-patienter (PT-kontrolgruppe), hvoraf 6 havde positiv, eksematisk PT-reaktion på Ni og 2 havde ingen PT-reaktion på Ni. Vurderingen af periprostetisk / (neo) kapselvævsrespons blev udført i henhold til den standardiserede konsensusklassifikation, der oprindeligt blev offentliggjort af Moraviet et al. i 2006 og revideret af Krenn et al. . Derudover blev der sat fokus på tilstedeværelsen af T-lymfocytter, B-lymfocytter, neutrofiler og makrofager—og desuden blev prober fra gruppe I, II og III patienter også sendt til mikrobiologisk evaluering. Flere uventede fund blev foretaget: 9/11 patienter i gruppe i og 6/9 patienter i gruppe II havde en kollagenfiberrig, bindevæv, der lignede periprostetisk vævsreaktion (type IV/ubestemt type). Og kun 5 af de 20 metalfølsomme patienter havde det samlede billede af den” slidpartikelinducerede type ” med makrofagdomineret respons. Dette er i modsætning til den generelle observation af for det meste slidpartikel/fremmedlegemsrespons som vævsmønster i mislykket artroplastik og til den eneste 15% Type IV (fibrotisk) responsreaktivitet i de 370 prøver analyseret af Moraviet et al. . Der var ingen tegn på infektioner i disse 20 prøver af vores gruppe i og II patienter. På trods af at det var en fremherskende “arthrofibrosis”-lignende, paucicellulær reaktivitet, blev tilstedeværelsen af lymfocytter bemærket i perivaskulær eller spredt fordeling (Figur 1(A) og 1(b)). I modsætning hertil viste ud af de 5 patienter uden metalfølsomhed to infektion, og lymfocytisk inflammation blev kun set hos en af disse patienter. Hos OA-patienter blev der igen noteret lymfohistiocytiske infiltrater sammen med fravær af neutrofiler. Disse resultater er opsummeret i tabel 2, 3 og 4. Figur 1(A) og 1 (b) er repræsentative histologiske fund hos patienter i gruppe i og II. biopsier fra Ni-inducerede allergiske plasterprøvereaktioner blev karakteriseret ved perivaskulære og undertiden diffuse lymfohistiocytiske infiltrater sammen med kontaktallergi-typiske epidermale ændringer som vist i en repræsentativ prøve(figur 2 (a)). Jørgen et al. spekuleret i, at perivaskulær eller diffus tilstedeværelse af (T-)lymfocytter i periprostetisk væv kunne fortolkes som hyperergisk respons . Von Domarus og kolleger beskrev imidlertid t-lymfocytinfiltration som et almindeligt fund i vævsprøver af hentede aseptisk løsnede Metal-på-polyethylenartroplastier. De konkluderer således, at hverken nekrobiose eller infiltration af T-lymfocytter bør anses for at være specifik for metaloverfølsomhedsreaktion.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 1

(a) eksempel på perivaskulær lymfocytisk infiltration; CD3 plet. (B) eksempel på spredte periprostetiske lymfocytter; CD3-plet.

(a)

(b)

(a)
(b)

figur 2

(a) histologi af patch test (PT) reaktion på Ni, der viser perivaskulære T-lymfocytiske infiltrater, spredte eosinofiler og epidermale “spongiotiske” ændringer. (B) relativ inflammatorisk mediatorekspression i biopsi af positiv PT-reaktion på Ni. Analyse baseret på semikvantitativ RT-PCR i realtid.

3.3. Cytokinekspressionsprofil

i betragtning af de delvist ufattelige publikationer spekulerede vi derefter på, om vurdering af inflammatorisk mediatorekspression kunne forbedre karakteriseringen af vævsresponsmønsteret. I figur 2 (b) er cytokin-RNA-ekspressionsmønsteret for en akut igangværende specifik kutan forsinket overfølsomhedsreaktion over for Ni vist. Større fund er den markante opregulering af IFNy som typisk markør for Th1-responset, der stimulerer det cellulære immunrespons og af IL-2, der indikerer t-celleaktivering og proliferation . Ved vurdering af grupperne af metal TKR-patienter med / uden metalfølsomhed og OA-kontrolgruppe var en sådan opregulering af IFNy også særlig synlig hos gruppe i-patienter, for eksempel TKR med komplikationer og patch testreaktivitet over for metaller. Ud af de andre mediatorer, der blev vurderet, var IL-2-ekspression hos TKR – patienterne mere fremtrædende i gruppe i og i OA-patientgruppe-og TGF-kur-ekspression lidt mere i gruppe i og II. dette er også tilfældet for IL-6 (i gruppe i og II) og en patient i gruppe II (patient med periprostetisk infektion). Disse andre mediatorer er ikke vist, da der kun var en vis individuel stigning i TNF hos OA-patienter, men ingen større forskel mellem de forskellige grupper. Øget Th1 lineage engagement afspejles af øget IFNy udtryk. Her fandt vi markeret IFNy opregulering ikke kun typisk i de Ni-inducerede PT-reaktioner, men især også i gruppe i TKR-patienter, hvilket antyder dens rolle i periprotetisk sygdomsprogression. Interessant nok rapporterede J Kristmsen og kolleger for nylig, at de fandt spredte CD3+ T-celler i grænsefladevævet af aseptisk løsnet hofteartroplastik med overvejende makrofagrelateret slidpartikelrespons. Hverken ved kvantitativ PCR eller ved immunhistokemi kunne de imidlertid vise signifikant Th1 (nemlig IFNy) eller TH2 (IL-4) mediatorekspression . Da bortset fra IL-6 især kan TGF-Kris spille en central rolle i begyndelsen og persistensen af periprostetisk, artikulær fibrose , vi analyserede her dets respektive ekspression i de forskellige vævsprøver. Vi observerede en stigning i TGF-kar-ekspression hos de metalfølsomme TKR-patienter med dog interindividuelle variationer. Figur 3(A)-3 (c) opsummerer disse resultater.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

figur 3

(a) Cytokinekspression af IFNy i vævene i de 5 forskellige patientgrupper; cytokinekspression blev analyseret i sammenligning med det husholdende gen EF-1 og til patienterne kontrollerer væv ved hjælp af Rrct-metoden. (B) Cytokinekspression af IL-2 i vævene fra de 5 forskellige patientgrupper; cytokinekspression blev analyseret i sammenligning med det husholdende gen EF-1 og til patienterne, der kontrollerer væv ved hjælp af Rrct-metoden; (test udført af SPSS statistisk programmel). C) Cytokinekspression af TGF-kar i vævene i de 5 forskellige patientgrupper; cytokinekspression blev analyseret i sammenligning med det husholdende gen EF-1 og til patienterne, der kontrollerer væv ved hjælp af den såkaldte Kurct-metode.

3.4. Sammenligning af præ-og postoperativ Kvindelig Score

19 af de 20 TKR-patienter svarede på vores anmodning og afsluttede en postoperativ Kvindelig score. 9 patienter rapporterede, at der ved revision var blevet implanteret en “hypoallergen” TKR (8 gange ti-baseret overfladebelægning, 1 gang oksiniumbaseret implantat). 8/9 patienter gjorde gavn af denne tilgang, som vist i figur 4. Indtil videre er der kun sagsrapporter eller små patientserier vedrørende den potentielle fordel ved brugen af “hypoallergen” TKR . Disse resultater understreger dog behovet for opfølgningsundersøgelser i større skala.

figur 4

kvinder score før og efter revision kirurgi i 9 patienter, der fik “hypoallergen” materiale (8 gange titanium, 1 gange oksinium). Score-systemet er blevet brugt i overensstemmelse med offentliggørelsen af Roos et al. .

der er dog begrænsninger i undersøgelsen: fakta om, at periprostetiske vævsprøver kun afspejler det faktiske trin i en dynamisk proces, og at OA-patienter muligvis ikke er så godt en “kontrol” som grænsefladevævssonder fra patienter med velfungerende implantater og det begrænsede prøvetal i denne undersøgelser. Således er der behov for yderligere undersøgelser for at validere den multimodulære diagnostiske tilgang i metalimplantatallergi.

4. Konklusioner

denne undersøgelse demonstrerer for første gang potentialet ved at anvende kombinerede analytiske trin til at give en tilgang til at udvikle diagnostiske egenskaber ved metalimplantatallergi. Allergidiagnostik (PT og LTT) og periprostetisk histologi peger på immunologisk respons på implantatlegeringsmetaller, og mønsteret af inflammatorisk mediatorekspression øger funktionel differentiering.

uventede fund var den fremherskende “fibrotiske” type IV-interface-respons hos de metalfølsomme TKR-patienter og den markerede IFNy-ekspression hos de PT-positive TKR-patienter.

interessekonflikt

forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt med hensyn til offentliggørelsen af dette papir.

anerkendelser

denne undersøgelse blev støttet af bevilling af Endo-Stiftung, Hamborg og bevilling af B Braun-Aesculap, Tuttlingen og Ludvig-Maksimilians-University of Munich.