Sletning af Kdm6a, en Histondemethylase, der interagerer med MLL2, hos tre patienter med Kabuki syndrom | Jumbuck

hovedtekst

Kabuki syndrom (KS; MIM 147920) blev først beskrevet i 1981 af Niikava og Kuroki,1,2 og mere end 400 tilfælde er rapporteret i litteraturen. De vigtigste kliniske egenskaber er karakteristiske ansigtstræk, udviklingsforsinkelse, mild til moderat intellektuel handicap, post-natal væksthæmning og yderligere funktioner, herunder skeletanomalier, hypodontia og vedvarende føtale fingerspidspuder. Sammenlignende genomisk hybridisering (CGH) mikroarray-analyse kunne ikke påvise en tilbagevendende anomali hos 72 KS-individer.3-8 brug af eksomsekventeringsstrategien førte for nylig til identifikation af mll2 (MIM 602113) mutationer som en væsentlig årsag til KS.9 ud af fem nyligt offentliggjorte serier blev mutationer i MLL2 fundet hos 56% -76% af KS-patienterne.9-13

fordi en betydelig andel af patienterne ikke har en påviselig mll2-mutation, postulerede vi eksistensen af yderligere gener forbundet med KS. I søgen efter en anden KS-forårsagende genetisk mutation blev ti gener, der interagerede med MLL2, screenet hos 15 mll2-mutationnegative KS-individer, og ingen patogene mutationer blev identificeret.11 et andet gen, der koder for et mll2-interagerende protein, KDM6A (tidligere kendt som MIM 300128), blev screenet hos 22 mll2-mutationsnegative KS-individer, og igen blev der ikke påvist nogen årsagsmutationer.13

ved hjælp af array CGH-analyse (Agilent platform 244k) identificerede vi de novo 11.3 mikrodeletioner hos to belgiske mll2-mutationsnegative KS-piger (patienter 1 og 2). Fordi begge sletninger var de novo, er de sandsynligvis patogene. Begge sletninger omfattede enten en del af eller hele KDM6A. desuden var der ingen kdm6a sletninger i en kohorte af 411 normale kontroller i en tidligere undersøgelse.14 deletionen hos patient 1 omfattede kdm6a-eksoner 21-29, som koder for den terminale del af det katalytiske domæne af KDM6A og Cksorf36, et gen, der for nylig er impliceret i K-forbundet autisme.15 hos patient 2 blev KDM6A, Cksorf36, DUSP21 (MIM 300678) og FUNDC1 (Figur 1) fjernet fuldstændigt. Funktionerne i DUSP21 og FUNDC1 forbliver ukendte.

11. 3 viser patienternes sletninger

Region 11.3 viser sletningerne trukket fra UCSC-Genomsøgeren (GRCh37/hg19) for patienter 1, 2 og 3. De sorte fulde spor repræsenterer hver patients sletning, og hver patients nummer er over hans eller hendes respektive spor. Sletningen i patient 1 spænder over 283,5 kb fra base 44.941.324 til base 45.224.829, patient 2 ‘ s sletning spænder over 815.7 kb fra base 44.377.858 til base 45.193.629, og patient 3 ‘ s sletning spænder over 45,4 kb fra base 44.866.302 til base 44.912.718. Generne i området er noteret under sletningssporene. CNV ‘ er i databasen med genomiske varianter vises på bundlinjerne. Der er ingen tidligere rapporter om kdm6a kopi-nummer ændringer.

vi sekventerede derefter KDM6A ved Sanger-sekventering og kiggede efter intragene sletninger eller duplikationer med en målrettet brugerdefineret Agilent array CGH i en kohorte på 22 MLL2-mutation-negative KS-individer (8 hunner, 14 hanner). I overensstemmelse med de etiske standarder for Institut de Pathologie et de G Kurstic ethics committee blev forældrenes samtykke opnået til DNA-analyse af alle deltagere i denne undersøgelse og til offentliggørelse af fotografier. CGH microarray data (supplerende data, tilgængelige online) diskuteret i denne publikation er blevet deponeret i National Center for Biotechnology Information (NCBI) genekspression Omnibus (GEO)16 og er tilgængelige under tiltrædelse GSE32567 (se afsnittet Tiltrædelsesnumre).

der blev ikke påvist nogen punktmutationer, men vi identificerede en de novo intragenisk deletion (eksoner 5-9) hos en italiensk, mandlig KS-person (patient 3). Vi sekventerede også UTY (MIM 400009), y-kromosomparalogen af KDM6A (se nedenfor) og kiggede efter intragene sletninger eller duplikationer som nævnt ovenfor, men vi registrerede ingen mutationer.

patienter 1 og 3 havde en typisk KS-fænotype, inklusive lange palpebrale sprækker, lateral eversion af det nedre øjenlåg og moderat til svær intellektuel handicap (tabel 1 og figur 2). Selvom ansigtsegenskaberne hos patient 2 ikke var så klassiske, viste hun mange træk ved denne lidelse, herunder lateral sparseness af øjenbrynene, lange øjenvipper, strabismus, lange palpebrale sprækker, store og fremtrædende ører, vedvarende føtale fingerspidser, aorta coarctation, areolar fylde i barndommen og hirsutisme. Hun præsenterede med en mild udviklingsforsinkelse og havde en normal verbal intelligenskvotient (ik) score, en dårlig præstation ik score og hyperaktiv adfærd (tabel 1 og figur 2). Vi bemærkede, at patienter 1 og 2 havde lange hallucinationer (figur 3).

ansigtsudseende hos berørte personer

(a) Patient 1.

(B) Patient 2.

(C) Patient 3.

Bemærk de lange palpebrale sprækker hos patienter 1 og 2 og de buede øjenbryn hos patienter 1 (mild) og 3.

udseende af fødder hos berørte personer

(a) Patient 1.

(B) Patient 2.

Bemærk de lange hallucinationer hos begge patienter.

således er kdm6a-sletningerne hos disse tre patienter forbundet med et bredt fænotypisk spektrum, der spænder fra typiske KS-individer (patienter 1 og 3) til en mildere klinisk præsentation (patient 2). Denne kliniske variabilitet er også et træk hos patienter med mll2-mutationer.13 de mulige virkninger af cksorf36-deletion hos patient 1 og af Cksorf36, DUSP21 og FUNDC1-deletion hos patient 2 på deres respektive fænotyper bør imidlertid også overvejes.

KDM6A (29 eksoner) er et af de kromosomale gener, der stort set undslipper inaktivering.17 Det koder for et 1.401 restprotein, der indeholder to funktionelle domæner. Det katalytiske domæne er en histondemethylase, der specifikt katalyserer demethylering af mono-, di-og trimethyleret lysin 27 på histon H3 (H3K27).18,19 denne demethylering medierer vævsspecifik ekspression af forskellige gener og er for det meste involveret i udviklingsprocesser og cellecyklussen.19-22 interessant nok virker KDM6A og MLL2 sammen i den epigenetiske kontrol af transkriptionelt aktivt kromatin ved at modvirke Polycomb-gruppe (PcG) proteiner.22 det andet funktionelle domæne af KDM6A spiller en rolle i kromatinomdannelse ved at interagere med omskifteren/saccharose ikke-fermenterbar (SL/SNF) remodelingskompleks, der indeholder transkriptionsaktivatoren Brg1.23

ligesom MLL2 spiller KDM6A en rolle i embryogenese og udvikling. Drosophila kdm6a ortholog) Drosophila mutanter manifestere ru øjne, dysmorfe vinger, og ændring af køn kamme.21 denne fænotype ligner trithoraks-fænotypen, hvilket yderligere understøtter forestillingen om, at KDM6A modvirker PcG-undertrykkelse.21 desuden er UTH – 1 (C. elegans KDM6A ortholog) kan påvirke udviklingsbeslutninger i C. elegans vulval precursorceller via transkriptionsregulering af gener, der koder for retinoblastom (RB) proteinkompleks, som er bevaret fra orme til mennesker.20 Kdm6a1 er også vigtig i ekspressionen af posterior HOKS gener i Sebrafisk.19 derudover spiller KDM6A sammen med MLL2 en vigtig rolle i reguleringen af muskelspecifikke gener under embryogenese.22,24 endelig rekrutterer medlemmer af en anden vigtig udviklingsgenfamilie (T-boks gener, der virker i mesoderm i dannelsen af hjerte og ryghvirvler) kdm6a for at aktivere deres målgener, hvilket igen understreger kdm6a ‘ s rolle i udviklingsprocesser.23 interessant nok er de fleste af de patogene mutationer for rapporterede T-boks-gener i humane sygdomme placeret i T-boks-domænet, der interagerer med KDM6A.23

KDM6A undslipper inaktivering,17 Men det er blevet foreslået, at kdm6a-ekspression fra det inaktive kromosom hos mus er signifikant lavere end det fra det aktive kromosom.25 kdm6a-ekspression er højere i den voksne hjerne, den voksne lever og specifikke udviklende hjerneområder hos kvinder end hos mænd.25. syny er paralogen af KDM6A på Y-kromosomet.17 UTY har 84% aminosyresekvenslighed med KDM6A og kan kompensere for den øgede ekspression af KDM6A hos kvinder, på trods af at demethylaseaktivitet endnu ikke er påvist for denne kdm6a paralog.14,25

det er ikke overraskende at finde et andet gen forbundet med KS på kromosom, fordi der har været rapporter om KS-lignende patienter med små ringkromosomer.26-34 derudover er der en klar overlapning mellem de medfødte hjertefejl, der er fremherskende hos mandlige KS-patienter (aortakarktation og andre venstre sidede forhindringer) og dem, der findes hos patienter med monosomi HS og r(H) kromosomer.28,35 små R(H) kromosomer fører typisk til Turners syndrom gennem fuldstændig inaktivering af r (H). Det er imidlertid uklart, hvorfor nogle individer udvikler en KS-lignende fænotype. Ufuldstændig kromosom inaktivering og den efterfølgende ekspression af normalt undertrykte gener er blevet foreslået som en forklaring på KS-fænotypen hos nogle r(H) patienter.32-34 KDM6A blev slettet hos de tre patienter, der både havde en KS-lignende fænotype og en r(H), hvor breakpoints var blevet kortlagt; dette fund er i overensstemmelse med hypotesen om, at kdm6a-sletning spiller en vigtig rolle i den KS-lignende fænotype observeret hos nogle patienter med en r(H).30,32,34 vi kunne ikke bevise haploinsufficiens for KDM6A hos patienter 1 og 2, fordi kdm6a-ekspression var meget lav i perifere blodlymfocytter (data ikke vist). Ikke desto mindre har undersøgelser vist,at to kopier af Kdm6a er nødvendige for normal ekspression i kvindelige musembryoer og voksne mus, 25 hvilket antyder, at haploinsufficiens kan være den patogene mekanisme. Denne forklaring ville imidlertid ikke redegøre for det faktum,at 45, H og andre r(H) patienter med en kdm6a-sletning ikke alle Udvikler Kabuki-fænotypen.

hos patienter 1 og 2 er de molekylære Inaktiveringsforhold stærkt skævt og er henholdsvis 89:11 og 97:3. Inaktiveringsprofilen blev bestemt via PCR-amplifikation af CAG-gentagelsen i ekson 1 af androgenreceptorgenet før og efter DNA-fordøjelse med HpaII og CfoI. For at bestemme, om den slettede kopi af KDM6A var placeret på det aktive eller inaktive kromosom, udførte vi fluorescens in situ hybridiseringsanalyse (FISH) med en kdm6a-probe på kromosomerne, der var differentielt mærket ved inkorporering af 5-bromo-2′-deoksyuridin (5-BrdU). Resultaterne viste, at den slettede kopi af KDM6A var placeret på det inaktive kromosom i alle de 70 mitoser, der blev analyseret hos begge patienter (figur 4). Det faktum, at KDM6A undslipper Røntgeninaktivering17 antyder, at phytohemagglutinin (PHA)-stimulerede lymfocytter, der har en slettet kopi af KDM6A på det inaktive kromosom, har en overlevelsesfordel i forhold til cellelinjer, der har en slettet kopi af KDM6A på det aktive kromosom. Dette forslag er i tråd med hypotesen om, at selvom KDM6A undslipper inaktivering, er dens udtryk lavere fra det inaktive kromosom end fra det aktive kromosom.25

5-BrdU

et billede af en FISKESTUDIE viser kromosomer differentielt mærket ved inkorporering af 5-BrdU. Det inaktive kromosom (i den hvide cirkel) ser lysere ud end det aktive kromosom. Subtelomere prober hybridiserer til begge kromosomer (blå pile). Kdm6a-signalet (hvid pil) er fraværende fra det inaktive kromosom og er til stede på det aktive kromosom. Til dette forsøg blev perifere blodlymfocytter fra patienter 1 og 2 stimuleret med phytohemagglutinin og blev dyrket i 72 timer. for at identificere det senreplikerende inaktive h-kromosom behandlede vi cellerne med 5-brdu (30 liter/ml) 5 timer før høst. Colcemid blev derefter tilsat til en koncentration på 0,2 liter/ml, og 1 time senere blev metafasepræparater fremstillet ved standardprocedurer, der involverede hævelse i 75 mM KCl og fiksering i 3:1 methanol/eddikesyre. Vi udførte FISKEANALYSE ved samtidig at bruge en subtelomerisk probe mærket med Spektrumorange (Vysis) for at angive kromosomerne (blå pil) og RP11-435k1 mærket med Spektrumorange (Amplituech) for at skelne mellem de slettede og ikke-slettede kromosomer (hvid pil). For at lette påvisningen af inkorporeret 5-BrdU denaturerede vi cellulært DNA i 2n HCl i 30 minutter ved 37 liter C. 5-BrdU blev derefter mærket med et 5-BrdU-specifikt monoklonalt antistof konjugeret til fluorescein (Roche) (1 liter/ml). Endelig modvirkede vi DNA ‘ et ved at anvende en antifade-opløsning indeholdende 0.1 kg / ml DAPI.

rollen som UTY er stort set ukendt, og den har ingen in vitro demethylase-aktivitet. Fundet af et mandligt KS-individ (patient 3) med en intragenisk deletion af KDM6A og med klinisk sværhedsgrad svarende til patientens 1 antyder, at UTY delvist kunne kompensere for tabet af KDM6A hos mandlige individer, som tidligere foreslået i litteraturen.25

hvad angår MLL2, er somatiske homosygøse og hemisygøse mutationer i KDM6A blevet identificeret i forskellige kræfttyper (multipelt myelom, esophageal pladecellecarcinom, nyrecellecarcinom, myeloid leukæmi, brystkræft, kolorektal cancer og glioblastom), hvilket antyder, at KDM6A er et tumorundertrykkende gen.14 ikke desto mindre er kræft ikke et centralt træk ved KS, da denne komplikation kun er rapporteret hos syv KS-patienter36,37 (akut lymfoblastisk leukæmi, Burkitt-lymfom, fibromyksoid sarkom, synovial sarkom og hepatoblastom blev rapporteret en gang, og neuroblastom blev rapporteret hos to KS-individer).35,36 hvis tab af begge alleler er tilstrækkeligt nok til at forårsage kræft, ville man forvente, at kræft forekommer hyppigere i KS, såsom i retinoblastom (MIM 180200) eller Vilms tumor (MIM 194070). Dette antyder enten, at tab af den anden allel i MLL2, KDM6A eller UTY er nødvendig, men ikke tilstrækkelig nok til kræftudvikling, eller at denne komplikation er underanerkendt, hvilket viser vigtigheden af naturhistoriske studier i sjældne syndromer.37

følgende histonmethylaser og histondemethylaser er blevet impliceret i andre multiple-anomali-syndromer: EHMT1 (MIM 607001; Kleefstra-syndrom ), SETBP1 (MIM 611060; GIEDION-syndrom ), JARID1C (MIM 314690; Claes-Jensen-Type, Mental retardationssyndrom), PHF8 (MIM 300560; Siderius-type, K-forbundet mental retardationssyndrom) og MLL2 i KS. Identifikationen af kdm6a patogene mutationer hos KS-patienter udvider histonmodifikationsfaktorernes rolle i intellektuel handicap og medfødt misdannelse.

afslutningsvis rapporterer vi KDM6A mutationer som årsag til KS hos en mand og to kvinder. Vores resultater bekræfter både KS genetisk heterogenitet og et locus på kromosom, som det tidligere er blevet foreslået. Fordi nogle KS-patienter var negative for MLL2, KDM6A og UTY-sekventering og ikke viste sletninger eller duplikationer under screening, er det sandsynligt, at andre KS-associerede gener stadig skal opdages.