introduktion
bioteknologi anvender mikroorganisme såvel som højere celler og deres aktive principper med det formål at opnå ønskelige konverteringer af forskellige substrater (Tripathi et al., 1997). L-phenylacetylcarbinol er udgangsmaterialet til kemisk syntese af L-efedrinhydrochlorid og pseudo efedrin farmaceutiske forbindelser anvendt som dekongestant, antiastmatikere (Shin og Rogers, 1995) og for nylig rapporteret, anvendt i fedmekontrol (Astrup et al., 1992). Aromatisk substrat bensaldehyd vil give L-PAC ved biotransformationsmetode. Visse gærstammer har pyruvatdecaroksylase (PDC) og alcholdehydrogenase (ADH), der producerer L-PAC og bensylalkohol, et biprodukt, henholdsvis fra Bensaldehyd (Nikolova og Afdeling, 1991). Biotransformationspotentialer i de voksende celler frie høstede celler immobiliserede celler og isoleret rå såvel som oprenset er blevet grundigt undersøgt., 1995; Shin og Rogers, 1996a, b).
nye stammers rolle i biokonverteringen er et vigtigt aspekt. L – PAC-produktion blev undersøgt af frie og immobiliserede celler af saccharomyces cerevisiae under forskellige vækst-og biotransformationsbetingelser. Ved at anvende forskellige nye stammer under forskellige vækst-og biotransformationsmetoder med henblik på at overvåge de ideelle forhold, der tillader maksimalt produktudbytte ved konstant substratkoncentration og celletæthed. L-PAC-produktion er angivet i skema 1.
| skema 1: | |
materialer og metoder
produktion af L-phenylacetylcarbinol med normale celler af Sccharomuces Cerevisiae (BY)
produktion af L-Pac (et vigtigt mellemprodukt for mange lægemidler) fra bensaldehyd ved gær er den potentielle vej i Fermenteringsindustrien til produktion af efedrin og andre lægemidler. Denne undersøgelse blev udført af forfatteren i Sultan-Ul-Uloom college of Pharmacy, der ligger i Hyderabad, Indien i år 2004.Stamkulturen af bagergær blev frisk subkultureret (Ellaiah og Krishna, 1987) på friske sterile Yema medium skrå og inkuberet ved stuetemperatur (ca. 28 liter C) i 36 timer.således blev 36 h-kulturen brugt til høst. Kulturen af bagergær blev høstet ved omrystning i 5 mL sterilt vand. Høstet mikrobiel suspension blev overført til Inokulummedium-I. sammensætningen af inokulummedium er som følger:
kolben blev inkuberet ved 28 liter C på en roterende ryster (180 o / min) i 24 timer.
det mikrobielle antal blev foretaget ved hjælp af Neubauer tællekammer. Den mikrobielle suspension blev fortyndet således, at hver mL suspension indeholdt 200h106 celler. Ti milliliter inokulum fra IM – I blev overført til 100 mL inokulationsmedium-II, hvis sammensætning er angivet nedenfor:
kolberne blev inkuberet på en roterende ryster (180 o / min) i 16 timer.
hundrede milliliter Produktionsmedier blev fremstillet. I det meste af undersøgelsen blev melassemedium anvendt som produktionsmedium og til sammenligningsundersøgelse sukkerrørsaftmedium med urinstof anvendt som produktionsmedium. Ti milliliter inokulum fra IM-II blev overført til Produktionsmedier, hvis sammensætning er den samme som IM-II og inkuberet i 9 timer på roterende ryster. Ved 9 timer blev næringsstof (20 mL 50% melasse) tilsat melasseproduktionsmedium og næringsstof (20 mL 50% sukkerrørsaft) tilsat henholdsvis sukkerrørsproduktionsmedium og inkuberet på roterende ryster. Fra 10 timer og frem 0.6% destilleret bensaldehyd blev tilsat i 6 opdelte doser med en halv times intervaller til produktionsmedium.
derefter blev kolber inkuberet på den roterende ryster i 24 timer. kolberne indeholdende 130 mL bouillon (dvs.100 mL produktionsmedium+10 mL inokulum+20 mL næringsmedium) blev behandlet med 130 mL bensin (opløsningsmiddel) og rystet i l5 min i adskillelsestragte. Derefter blev det organiske lag adskilt og filtreret gennem absorberende bomuld. Endelig blev opløsningsmidlet destilleret for at få L-PAC-produkt.
produktion af L-phenylacetylcarbinol med nye isolater af gær:
procedurer for Biokonversion:
i sammenlignende undersøgelser blev de nye kulturer brugt til at estimere og sammenligne deres biotransformationspotentiale med bagergær. Stamkulturerne af Candida pseudointermedia MTCC No. 6225, Candida pseudountermedia MTCC No. 6352 og issatchenkia orientalis MTCC No. 6351 blev subkultureret aseptisk på Strile Yema-skråninger med steriliseret overføringssløjfe i det sterile område (laminær luftstrøm).
tidligere nævnte procedure (Ellaiah og Krishna, 1987) blev gentaget for de nye stammer også. I det meste af undersøgelsen blev melassemedium anvendt som produktionsmedium og til sammenlignende undersøgelse blev sukkerrørsaftmedium med urinstof (Kaur og Kocher, 2002) anvendt som produktionsmedium.
resultater og diskussion
L-Phenyl acetyl carbinol er en gul farve væske. Dens rapporterede specifikke tyngdekraft er 0,93 ved stuetemperatur. L-PAC produceret af isolater inklusive bagergær (S. cerevisia) viste den samme specifikke tyngdekraftsværdi. pH-værdien af L-PAC (forholdet 1: 1 mellem L-PAC-prøve og vand) rapporteres som 3,84. I disse eksperimenter viste l-PAC-produktet opnået gennem biotransformation af fire forskellige gær som bagergær, Candida pseudointermedia (6225), Candida pseudointermedia (6352) og issatchenkia orientials (6351) de samme pH-værdier. Rf-værdi af L-PAC blev rapporteret (Groger og Erge, 1965) i chloroform som mobil fase på silicageljoddampe blev anvendt til påvisning af pletter.
ved udvikling af kromatogrammer blev chloroform som frontopløsningsmiddel sammenlignet med opløsningsmiddelblanding (30% ethylacetat 70% geksan) som mobil fase. Den senere opløsningsmiddelfront viste bedre adskillelse end chloroform. Så vi brugte 30% ethylacetat og 70% heksan som opløsningsmiddel foran i alle vores eksperimenter.
L-PAC er også reaktivt i UV-lys, joddampe og charring. Rf-værdien af standard L-PAC er omkring 0,33. L-PAC-produkt af forskellige isolater viste den samme Rf-værdi.
den methylketon, der er til stede i L-PAC, gennemgår Idoformreaktionen (Smith og Hendlin, 1954). Det gennemgår oprindeligt halogenering og spaltningen i nærvær af alkali som NaOH for at give anledning til Idoform. Denne reaktion er meget specifik for L-PAC og forekommer ikke med by-produkter. L-PAC produceret af forskellige isolater gav anledning til Idoform.
ved polarimetriske og kolorimetriske skøn blev den procentvise biokonversion estimeret i forskellige gærisolater. Andre fermenteringsprodukter (f.eks. Den kemiske struktur af L-PAC blev identificeret og i overensstemmelse med 1H NMR og UV spektrale data.
flere arbejdere (Ellaiah og Krishna, 1987) udførte gæring i melasse som produktionsmedium, ud over det i industrien bruger melasse medium til biokonverteringsreaktion i L-PAC-produktionen.
i denne undersøgelse forsøgte vi sukkerrørsaften som produktionsmedium i L-PAC-produktion. Sukkerrørsaft med 0,25% urinstof blev anvendt som produktionsmedium, hvilket gav mere produkt af L-PAC end melasse. Ud over dette produkt var ekstraktion fra sukkerrørsaftmediet meget praktisk end fra melassemediet. % Biokonversion opnået med forskellige gærisolater er vist i tabel 1.
Biotransformationspotentialet for frie celler af bagergær (S. cerevisiae) blev undersøgt i både melasse og sukkerrørsaft som produktionsmedium. I melasse blev der observeret medium 25% biokonversion, hvor der som i sukkerrørsaft blev observeret medium 28% biokonversion.
| tabel 1: | omdannelse af melasse og sukkerrørsaft som produktionsmedie ved produktion af L-PAC |
Biotransformationspotentialet for frie celler af Candida pseudointermedia MTCC No. 6225 blev undersøgt i både melasse og sukkerrørsaft som produktionsmedium. I melasse blev der observeret 23,43% biokonversion, hvor der som i sukkerrørsaft blev observeret medium 23,75% biokonversion.
Biotransformationspotentiale for frie celler af Candida pseudointermedia MTCC nr. 6352 blev undersøgt i både melasse og sukkerrørsaft som produktionsmedium. I melasse blev der observeret 33,47% biokonversion, hvor der som i sukkerrørsaft blev observeret medium 48,76% biokonversion.
Biotransformationspotentialet for frie celler af ISSATCHENKIA orientalis MTCC No. 6351 blev undersøgt i både melasse og sukkerrørsaft som produktionsmedium. I melasse blev der observeret 37,16% biokonversion, hvor der som i sukkerrørsaft blev observeret medium 60,61% biokonversion.
konklusion
som konklusion er den nuværende procedure for anvendelse af nye gærstammer fra naturlige kilder til biotransformationsundersøgelser undersøgt og anvendt til biokonvertering af bensaldehyd til L-PAC. Tre stammer blev isoleret fra forskellige naturlige kilder som blackdrues, dadelfrugt og sukkerrørsaft og blev identificeret ved Institute of Microbial Technology, Chandigarh. Disse tre stammer blev betegnet som Candida pseudointermedia MTCC No. 6225 (BGY), Issatchenkia orientials MTCC No. 6351 (DY), Candida pseudointermedia MTCC No. 6352 (SCY).Hvilket vil være en vigtig tilføjelse til de nuværende eksisterende procedurer. De væsentligste resultater af den nuværende forskning er anvendelse af 3 nye gærstammer til produktion af L-PAC og anvendelse af sukkerrørsaft som produktionsmedium til produktion af L-PAC. Vi har succes i begge forsøg, og der er en betydelig stigning i det procentvise udbytte af L-L-PAC, når sukkerrørsaft blev brugt som produktionsmedium. Selvom sukkerrørsaft er dyr sammenlignet med melasse, ekstraktionsproceduren viste sig at være meget lettere med sukkerrørsaft sammenlignet med melasse. Yderligere forskningsmetoder som forskellige faktorer, immobiliseringsundersøgelser, mutationsundersøgelser osv., kunne hjælpe med at etablere de omkostningseffektive metoder til produktion af L-PAC ved at bruge sukkerrørsaft som produktionsmedium. Dette er den første rapport om brug af Candida pseudointermedia og issatchenkia orientalis til biokonverteringsundersøgelser af Bensaldehyd til L-PAC. Anvendelse af sukkerrørsaft som produktionsmedium i biotransformationsundersøgelser af bensaldehyd til L-PAC er også den første rapport af sin art. Desuden viste sukkerrørsaft øget biokonversionspotentiale end melasse medium. De nye stammer, vi kan udforske for de forskellige kemiske reaktioner. Yderligere undersøgelser i denne retning er i gang.
anerkendelser
forfatterne er taknemmelige for IMTECH, Chandigarh for at identificere de nye stammer og tildele MTCC-numrene.
