Kinase Assay
fremstillet af skår Arur
proteinkinase (stamopløsninger på 1-10 mg/ml rene kinaser) – til disse analyser bruger jeg renset ERK2 kinase (NEB). Det er vigtigt at bestemme den optimale buffer, ionstyrke og pH for aktivitet. Hvis disse betingelser ikke er fastlagt, kan nedenstående protokol bruges som udgangspunkt.
substrat (stamopløsning på 10 mM) – substrater indeholder typisk et serin /threonin i et phosphoryleringsstedsmotiv. Som kontrol bruger jeg Myelin-Basisproteinet (opnået fra Sigma), som blev brugt af NEB til at kalibrere ERK2-kinasen.
derudover skal substraterne have en nettopositiv ladning for at lette bindingen til phosphocellulosefiltre, der anvendes i analysen. Til kvantitativ binding til phosphocellulosepapiret anbefales det at have mindst 2 basiske rester og en fri amino-Terminal. Hvis et phosphoryleringsstedsmotiv ikke er kendt, kan der anvendes et generelt tyrosinkinasesubstrat. For eksempel “myelin basisk Protein” (er et ikke-specifikt substrat for mange MAPKs). Til indledende reaktioner bør der anvendes en substratkoncentration på 0,7-1,5 mM. For at bestemme de kinetiske parametre for phosphorylering af det syntetiske peptid kræves en række peptidkoncentrationer
10 gange Kinasebuffer – indeholder 5 mg/mL BSA (for at forhindre kinaseadsorption til analyserøret), 150 mM Tris-Cl (pH 7,5).
ATP/MgCl2 (købt fra Upstate Biotech – Magnesium/ATP Cocktail # 20-113) – en stamopløsning på 1-5 mM er praktisk. Bemærk, at de fleste kort har Km-værdier for ATP i området 10-150 uM, så for kinetiske eksperimenter er det vigtigt at bruge mættende koncentrationer af ATP for at nå frem til værdier af Km og Vmaks for peptiderne.
ATP – 10 mCi/mL.
ERK2 Kinase Assays
a) autoradiografi ASSAY:
- en standard kinaseanalyse udføres i et volumen på 25 ul:
- 2,5 ul af 10 gange kinasebuffer
- 5 ul af 1,0 mM MgCl2 /ATP (0,2 mM slutkoncentration)
- ATP (100-500 cpm/pmol)
- 3 ul af 10 mM substrat (1.2 mM endelig koncentration)
- 1 U af ERK2-kinasen
- H2O til 25 ul
1. Før forsøgene skal du forberede en cocktail, der indeholder nok buffer, ATP og ATP til at fuldføre analyserne. Ved analyser ved forskellige substratkoncentrationer skal substratet fortyndes og tilsættes separat til hvert rør. Efter dispensering af cocktailen i 1,5 ml mikrocentrifugerør placeres rørene i et vandbad ved 30 grader C i 30 minutter. Reaktioner bør initieres ved tilsætning af kinase og lov til at fortsætte ved 30 grader C.
2. Efter den ønskede tid afsluttes reaktionerne ved at tilsætte 2 SDS-prøvebuffer og løbe tør på en gel.
3. Tør gelen på et papir 3.0, og udsæt den tørre gel for et autoradiogram, og hold kassetten på-70C i 2 timer. (ved længere eksponeringer skal du sørge for, at filmen er tør igen, før du sætter et nyt autoradiogram på det).
b) kinetisk analyse:
1. Udfør kinaseanalysen som ovenfor, Brug denne gang forskellige koncentrationer af substraterne fra 50 nm til 1 mm. Stop reaktionen efter 30 minutter ved at tilsætte 45 ul iskold 10% trichloreddikesyre (TCA) til hver reaktion. Hvirvle reaktionerne.
3. Spin i 2 minutter i mikrocentrifuge (10k omdr. / min.).
4. Spot 35 ul af supernatanterne på 2,1 cm diameter papirpapir P81 cellulosefosfatfiltercirkler.
6. Vask P81-filtercirklerne tre gange med 500 ml kold 0,5% fosforsyre (5-10 minutter pr. Forløbet af vasketrinnene kan følges ved at fjerne P81-filtercirklen for en tom reaktion og kontrollere den med en Geiger-tæller.
7. Vask en gang med 200 ml acetone ved stuetemperatur i 5 minutter.
8. Lad filtercirklerne tørre ved stuetemperatur.
9. Sæt filtercirkler i scintillationshætteglas, og mål 32P inkorporering ved at tælle puderne tørre i en scintillationstæller. Den specifikke aktivitet af ATP i en kinasereaktion (f.eks. i cpm/pmol) kan bestemmes ved at spotte en lille prøve (2-5 ul) af reaktionen på en P81-filtercirkel og tælle direkte (ingen vask). Minut opnået i kinasereaktionen (minus blank) divideres derefter med den specifikke aktivitet for at bestemme mol phosphat overført i reaktionen.
kinetik af Substratphosphorylering
de kinetiske parametre for phosphorylering af et substrat med en MAPK kan bestemmes ved hjælp af en variation på protokollen ovenfor.
1. Udfør en reaktion ved en høj koncentration af substrat for at fastslå, at proteinet er et substrat.
2. Varier koncentrationen i analysen. Under analysens betingelser bør fosforyleringshastigheden være proportional med koncentrationen. Dette eksperiment bruges også til at bestemme den mængde, der er nødvendig til de kinetiske undersøgelser.
for at bestemme hastigheder skal der udføres et tidsforløb for substratphosphorylering. I dette tilfælde skal du forberede en større reaktion (vi bruger 150 ul). På de ønskede tidspunkter trækkes 25 ul-alikvoter ud og overføres til mikrocentrifugerør indeholdende 45 ul iskold 10% TCA og analyserer reaktionerne som beskrevet ovenfor. Phosphorylering af substratet bør være lineært med tiden, og til måling af kinetiske konstanter bør de indledende reaktionshastigheder (5%) anvendes.
3. Varier substratkoncentrationen i analysen. Brug et plot af hastighed vs. peptidkoncentration for at få et indledende skøn over værdien af Km. 20 uM til 2 mM) bør anvendes i denne indledende måling.
4. For at bestemme Km (substrat) og Vmaks skal du variere substratkoncentrationen og måle hastigheden af fosfatoverførsel. Et godt udvalg af substratkoncentrationer er følgende multipla af Km: 0,125 km, 0,25 Km, 0,5 Km, 1,0 Km, 2,0 Km, 4,0 Km, 8,0 Km. Reaktionerne skal udføres i tre eksemplarer for at opnå de bedste resultater.
5. Kinetiske konstanter bestemmes af vægtede ikke-lineære mindste firkanter, der passer til den hyperbolske hastighed vs. plots ved hjælp af iterative programmer som f.eks Nfit (Island Products, Galveston).
beregning af RAR:
RAR: relativ Acceptorforhold = Vmaks / Km defineret som et samlet mål for et proteins evne til at fungere som et substrat.
jeg normaliserer RAR for et givet substrat med Myelinbasisk Protein, dvs.beregne værdien af RAR for hvert substrat og divider det derefter med værdien af RAR af Myelinbasisk Protein (således indstilling MBP ved 1,0).
