Slå ned og slå ud gener

Gen slå ned
denne teknik tillader reduktion af ekspressionen af en eller flere af anorganisme. Dette kan ske gennem genetisk modifikation eller ved behandling med areagent, såsom et kort DNA-eller RNA-oligonukleotid, der har en sekvensekomplementær til enten gen eller et mRNA-transkript.
hvis ændringen i genekspression er forårsaget af et oligonukleotid, der binder til et mRNA eller midlertidigt binder til et gen,fører dette til en midlertidig ændring i genekspression, der ikke modificerer det kromosomale DNA, og resultatet kaldes en “forbigående nedslag”.
i en forbigående nedslagning forårsager bindingen af dette oligonukleotid til activegenet eller dets transkripter nedsat ekspression. Binding kan forekomme gennem blokering af transkription, nedbrydning af mRNA-transkriptet (f. eks. siRNA eller RNase-h-afhængig antisense) eller gennem blokering af enten mRNA-translation, præ-mRNA-splejsningssteder eller nuklease-spaltningssitter, der anvendes til modning af andre funktionelle RNA ‘ er, herunder miRNA (e.g.by morpolino oligos).
den mest direkte anvendelse af forbigående nedslag er for at lære om et gen, derer blevet sekventeret, men har en ukendt funktion. Denne eksperimentelle tilgang er kendt som omvendt genetik. Transiente nedslag anvendes oftei udviklingsbiologi, fordi oligoer kan injiceres i encellede gygoter og vil være til stede i dattercellerne i den injicerede celle.

RNA-interferens (RNAi)er et middel til at dæmpe gener ved hjælp af mRNA-nedbrydning. Denne metode opnås ved at indføre små dobbeltstrengede interfereringrna ‘ er (siRNA) i cytoplasmaet. Når den først er indført i cellen, eksogenesirna ‘ er behandles af RISC. SiRNA supplerer targetmRNA, der skal tavles, og RISC bruger siRNA som en skabelon til lokalisering af Target mRNA. Efter at RISC er lokaliseret til mål-mRNA ‘ et, spaltes RNA afya ribonuklease.
RNAi bruges til genetisk funktionel analyse. Anvendelsen af RNAi kan være nyttig til at identificere potentielle terapeutiske mål, lægemiddeludvikling eller andre applikationer.

Gene Knocking-out
Geneknockout (KO) er en genetisk teknik, hvor en af en organisms gener erlavet inoperativ. Knockout organismer bruges til at studere genfunktion, normaltved at undersøge effekten af gentab. I førstnævnte er kun en allel slået ud, i sidstnævnte er begge de to alleler slået ud.

den rettede oprettelse af en KO begynder i reagensglasset med et plasmid,et bakterielt kunstigt kromosom eller anden DNA-konstruktion ogFortsæt til cellekultur. Celler transficeres med DNAconstruct. Ofte er målet at skabe et transgent dyr, der harændret gen.
i så fald transformeres embryonale stamceller genetisk og indsættes i tidlige embryoner. Resulterende dyr med den genetiske ændring ideres kimlinjeceller kan så ofte passere gen knockout til fremtidige generationer.

konstruktionen er konstrueret til at rekombinere med målgenet, hvilket gøres ved at inkorporere sekvenser fra selve genet ind i konstruktionen.Rekombination forekommer derefter i regionen af denne sekvens inden i genet,hvilket resulterer i indsættelse af en fremmed sekvens for at forstyrre genet.
en betinget knockout tillader gensletning i et væv eller en tidsspecifik måde. Dette gøres ved at indføre lokaliteter omkring genet. Disse følgevirkninger vil blive indført i kimlinjen via den samme mekanisme som en knock-out. Denne kimlinie kan derefter krydses til en anden kimlineindholdende Cre-rekombinase, som er et viralt ferment, der kan genkende disse sekvenser, rekombinerer dem og sletter genet flankeret af disse steder.
da thedna-rekombination er en sjælden begivenhed, inkluderer den udenlandske sekvens, der er valgt tilindsættelse, normalt en reporter. Dette muliggør let valg afceller eller enkeltpersoner, hvor knockout var vellykket. Nogle gange indsætter DNAconstruct i et kromosom uden den ønskede homologe kombination med målgenet.

(Ivana Venesia)

slå ned
det er en teknik, hvormed ekspressionen af et gen reduceres. Denne reduktionkan skyldes en DNA-modifikation eller fra en oligonukleotidbinding enten til mRNA eller til genet. I dette tilfælde er ekspressionsændringen midlertidig, så vital om forbigående nedslag.
en af de teknikker, der tillader forbigående nedslagning af et gen beståri brugen af Morpolinooligomerer. De er blevet et standard nedslagsordi dyreembryonale systemer, så Morpolinooligos bruges ofte til at undersøge rollen som et specifikt mRNA-transkript iet embryo. Dens molekylære struktur har DNA-Baser bundet til en rygrad afmethylenemorfolinringe bundet gennem phosphorodiamidatgrupper. Morpholinos blokerer adgang for andremolekyler til små (~25 base) specifikke sekvenser af basisparringsoverfladerneaf ribonukleinsyre (RNA). Fordiaf deres helt unaturlige rygrad er Morpholinos ikke genkendt afcellulære proteiner. Nukleaser nedbryder ikke morpholiner, og de nedbrydes heller ikke i serum eller i celler. Der er ingen offentliggjorte rapporter om morpholiner, der aktiverer toll-lignende receptorer eller medfødte immunresponser såsom interferoninduktion eller det NF-kB-medierede inflammationsrespons.Morpholinos er ikke kendt for at modificere DNA-methylering.
Morpholinos udløser ikke nedbrydningen af deres mål-RNA-molekyler,i modsætning til mange antisense-strukturelle typer (f.eks. I stedet Morpolinosact ved” sterisk blokering”, binding til en målsekvens inden for et RNA,inhiberende molekyler, der ellers kan interagere med RNA.
Morpholinos kan også ændre splejsningen af præ-mRNA eller hæmme modningen og aktiviteten af miRNA.
Blokeringtranslation
bundet til 5′-utranslateretregion af messenger RNA (mRNA), kan Morpholinos interferere medprogression af ribosomalt initieringskompleks fra 5′ cap til startcodon. Dette forhindrer oversættelse af kodningsområdet for det målrettede transkript (kaldet “slå ned”genekspression). Dette er nyttigt eksperimentelt, når en undersøgerønsker at kende funktionen af et bestemt protein; Morpholinos giver et praktisk middel til at slå ned ekspression af proteinet og lære hvordanat slå ned ændrer cellerne eller organismen.
ændring af præ-mRNA-splejsning
Morpolinoscan interferere med præ-mRNA-behandlingstrin enten ved at forhindreplice-dirigere små nukleare ribonukleoproteiner (snRNP)-komplekserfra binding til deres mål ved grænserne af introner på en streng afpre-mRNA eller ved at blokere den nukleofile adeninbase og forhindre den i at danne splejsningslariatstrukturen eller ved at forstyrre bindingen af splejsningsregulerende proteinersåsom splejselyddæmpere og splejsningsforstærkere. Forebyggelse af binding af snRNP U1 (på donorstedet) eller U2/U5 (på polypyrimidindelen og acceptorstedet) kan forårsagemodificeret splejsning, almindeligvis eksklusive eksoner framodent mRNA. Målretning mod nogle splejsningsmål resulterer i intronindeslutninger, mens aktivering af kryptiske splejsningssteder kan føre til delvise indeslutninger eller udelukkelser.Mål for U11 / U12 snrnp ‘ er kan også blokeres. Splejsningsmodifikation kan værebekvemt analyseret ved revers-transkriptase polymerasekædereaktion (RT-PCR)og ses som et båndskift efter gelelektroforese af RT-PCR-produkter.
KNOCKOUT
en variation af den traditionelle gen knockout er den betingede gen knockout.
betinget gen knockout er en teknik, der bruges til at eliminere et specifikt gen i et bestemt væv, såsom leveren. Denne teknik er nyttigat studere de enkelte geners rolle i levende organismer. Det adskiller sig fratraditionel gen knockout, fordi den er målrettet mod specifikke gener på bestemte tidspunkter snarere end at blive slettet fra livets begyndelse. Brug af den betingede geneknockout-teknik eliminerer mange af bivirkningerne fra traditionel gen knockout. Ved traditionel gen knockout kan embryonal død fra en genmutation forekomme, og dette forhindrer forskere i at studere genet ivoksne. Nogle væv kan ikke undersøges ordentligt isoleret, så genet skalvære inaktiv i et bestemt væv, mens de forbliver aktive i andre. Med detteteknologi, forskere er i stand til at knockout gener på et bestemt stadium iudvikling og studere hvordan knockout af et gen i et væv påvirker det samegene i andre væv.
den mest anvendte teknik er Cre-loksrekombinationssystemet. CRE-rekombinasen genkender specifikt tooks (loci for rekombination) steder inden for DNA og forårsager rekombination mellem dem. Denne rekombination vil forårsage en sletning eller inversionaf generne mellem de to lokssteder afhængigt af deres orientering. Anentire gen kan fjernes eller inaktiveres. Hele dette system er inducerbart, så achemisk kan tilføjes for at slå gener ud på et bestemt tidspunkt. To af de mest almindeligt anvendte kemikalier er tetracyclin, som aktiverer transkription afcre-rekombinasegenet og tamoksifen, som aktiverer transport af Crerecombinaseproteinet til kernen. Kun få celletyper udtrykker Crerecombinase, og ingen pattedyrceller udtrykker det, så der er ingen risiko for utilsigtet aktivering af lokaliteter ved anvendelse af betinget genknockout hos pattedyr.
en mus, der indeholder Cre-genet, og en mus, der indeholder loksp-sekvenserne, opdrættes for at generere en betinget knockout for en bestemt interesse. Musene udtrykker ikke naturligt CRE-rekombinase eller loksites, men de er blevet konstrueret til at udtrykke disse genprodukter for at skabe det ønskelige afkom. Du er nødt til at få en mus, hvor en vigtig ekson er flokset (det betyder, at den har aloks-P opstrøms og nedstrøms) og en mus, der har en Cre-sekvens, hvis udtryk er reguleret af en celletypespecifik promotor eller en inducerbar promotor. Derefter krydser du disse mus, og du får en mus, hvor cellerne, der ikke udtrykker Cre, vil have genet med en normal funktion, mens cellerne, der udtrykker Cre, vil have en genfunktion forstyrret idelen mellem Loks-P.
(Francesca Luca)

RNA interferensmekanisme

RNA-interferensen (RNAi), en gammel cellulær antiviral respons, er en naturlig mekanisme til dæmpning af genekspression. Det kan udnyttes til at tillade specifik hæmning af funktionen af anytarget gen. RNAi viser sig at være et uvurderligt forskningsværktøj, det hjælper med at identificere nye gener involveret i sygdomsprocesser.

RNAi er ikke den eneste mekanisme afsilencing genekspression (tabel 1).

tabel 1: sammenligning mellem forskellige metoder til genhæmning.

RNA-interferens (RNAi) forekommer som reaktion på introduktionen af dobbeltstrenget RNA (dsRNA)i en celle. DsRNA-introduktionen udløser aktiveringen afdsrna-afhængig proteinkinase-R (PKR). Aktiveret PKR phosphorylerer translationsinitieringsfaktoren EIF2: denne effekt i forbindelse med aktivering af Rnase-L og induktion af interferonproduktion stopper proteinsyntese og fremmer apoptose. Samlet set menes dette at repræsentere en antiviralforsvarsmekanisme. Rnaier en meget bevaret mekanisme i hele taksonomiske arter . Ud overhar en antiviral aktivitet menes RNAi også at undertrykke ekspressionen af potentielt skadelige segmenter af genomet, såsom transposoner, som ellers destabiliserer genomet ved at virke som insertionelle mutagener.

selvom dens mekanismer ikke er fuldt belyst, repræsenterer RNAi resultatet af en flertrinsproces(Figur 1). Når de kommer ind i cellen, er lange dsRNA ‘ erførst behandlet af RNase III Dicer. Denne funktionelle dimer indeholderhelikase -, dsRNA-bindings-og PASDOMÆNER (deres roller er ikke fuldstændigteluciderede). Dicer producerer 21-23 nukleotid dsRNA-fragmenter med toonukleotid 3’ endeoverhæng, dvs.sirna ‘ er. RNAi medieres af RNA-induceretsilencing kompleks (RISC), som styres af siRNA, genkender mRNA indeholdende asekvens homolog til siRNA og spalter mRNA på et sted placeretcirka midt i den homologe region. Således er genekspressionspecifikt inaktiveret på et post-transkriptionelt niveau.

I C. elegans, Dicer er blevet vistat interagere med rde proteiner. Rde-proteinerne binder til lang dsRNA og menes at præsentere den lange dsRNA til Dicer til behandling. Mutanter, der viser en høj grad af resistens over for RNAi, er rapporteret at have mutationer atrde-1 og rde-4 loci.

Figur 1: mekanisme for RNAinterference

udseendet af dobbelttrandet (ds) RNA i en celle (f. eks. som en konsekvens af virusinfektion)udløser et komplekst respons, som blandt andet inkluderer fænomener (f. eks.interferon produktion og dens konsekvenser) en kaskade af molekylære hændelser kendtsom RNAi. Under RNAi binder den cellulære Dicer sig til dsRNA og spalter den i korte stykker på ~ 20 nukleotidpar i længden kendt som smallinterfering RNA (siRNA). Disse RNA-par binder sig til cellulært kaldet drna-induceret lyddæmpningskompleks (RISC), der bruger en streng af siRNA til at binde til enkeltstrengede RNA-molekyler (dvs.mRNA) af komplementær sekvens. Kerneaktivitet af RISC nedbryder derefter mRNA ‘ et og dæmper således ekspression af det virale gen. Tilsvarende antages det genetiske maskineri af celler at stimulere RNAi til at kontrollere ekspressionen af endogent mRNA og således tilføje et nyt lag af post-transciptional regulering. RNAi kan udnyttes ieksperimentelle indstillinger til at slå målgener af interesse ned med en højspecifik og relativt let Teknologi (Se tekst for flere detaljer).

udover genesilencing kan RNAi være involveret i andre fænomener af genregulering.. Det ser ud til, at RNAi også kan fungere ved methylering af cytosiner såvel som Cpgsekvenser, der er mere klassisk forbundet med methylering. Hvis målsekvenserne deler homologi med en promotor, transkriptionel lyddæmpning kan forekomme viamethylering. Desuden synes RNA at interagere med kromatindomæner, som i sidste ende kan lede DNA-methylering. Undersøgelser af C. elegans har vist detrnai kan sprede sig blandt celler gennem mekanismer, der muligvis ikke hænger sammen med siRNA.Det systemiske RNA-interferensmangel (sid) locus, sid-1, koder for et konserveret protein med en signalpeptidsekvens og 11 formodede transmembrandomæner,hvilket antyder, at sid-1-proteinet kan fungere som en kanal for lang dsRNA,siRNA eller et aktuelt uopdaget RNAi-relateret signal. Sid-1 mutanter beholder celle-autonom RNAi, men viser ikke spredning af RNAi. Det forbliver uklart, om denne systemiske RNAi forekommer hos pattedyr, selvom der rapporteres om en stærk lighed mellem sid-1 og forudsagte humane og museproteiner.

(Justine Floret)

kilde : https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/1479-5876-2-39#Sec3

lang=”da-dk” :lang= “da-dk”>

disse tre molekylære teknologier gør det muligt at editere genomet på en stedsspecifik måde, hver teknik med en anden mekanisme. Transskriptionsaktivatorlignende effektornukleaser (TALENs) er kimære nukleaser sammensat af programmerbare, sekvensspecifikke DNA-bindende moduler knyttet til et ikke-specifikt DNA-spaltningsdomæne. Ved at inducere DNA-dobbeltstrengsbrud, der stimulerer fejlbehæftet ikke-homolog slutforbindelse eller homologistyret reparation på specifikke genomiske steder.

billede taget fra http://gentaur-italy.com/prodotti/talen-un-sistema-semplice-e-veloce-per-gene-knockout/

alsidigheden af FNs og TALENs stammer fra evnen til at tilpasse det DNA-bindende domæne til at genkende stort set enhver sekvens. Disse DNA-bindende moduler kan kombineres med adskillige effektordomæner for at påvirke genomisk struktur og funktion, herunder nukleaser, transkriptionsaktivatorer og repressorer, rekombinaser, transposaser, DNA-histonmethyltransferaser og histonacetyltransferaser. Evnen til at udføre genetiske ændringer afhænger således i høj grad af DNA-bindende specificitet og affinitet af designede finger-og FORTÆLLINGSPROTEINER.

Cys2-His2 – fingerproteiner

cys2-His2-fingerdomænet er blandt de mest almindelige typer DNA-bindende motiver, der findes i eukaryoter og repræsenterer det næst hyppigst kodede proteindomæne i det humane genom. En individuel sinc-finger består af ca. 30 aminosyrer i en konserveret cholertikonfiguration. Flere aminosyrer på overfladen af den krupniske spiral kommer typisk i kontakt med tre basepar i den store rille af DNA, med varierende niveauer af selektivitet. Den modulære struktur har gjort dem til en attraktiv ramme for design af brugerdefinerede DNA-bindende proteiner. En af de mest almindelige årsager til DNA-genkendelse er udviklingen af unaturlige arrays, der indeholder mere end tre domæner. Dette fremskridt blev lettet ved den strukturbaserede opdagelse af en stærkt konserveret linkersekvens, der muliggjorde konstruktion af syntetiske sinc-fingerproteiner, der genkendte DNA-sekvenser 9 til 18 bps i længden. Fordi 18 bps DNA-sekvens kan give specificitet inden for 68 milliarder BP DNA, tillod denne metode, at specifikke sekvenser blev målrettet i det humane genom for første gang.

Transkriptionsaktivatorlignende effektorer

fortællinger er naturligt forekommende proteiner fra plantepatogen bakterier Slægt Ksanthomonasog indeholder DNA-bindende domæner sammensat af en serie på 33-35 aminosyregentagelsesdomæner, som hver genkender en enkelt bp. TALE specificitet bestemmes af to hypervariable aminosyrer, der er kendt som repeat-variable diresidues (RVD ‘ er) . Modulære fortællinger gentages sammen for at genkende sammenhængende DNA-sekvenser. Imidlertid var der ingen omlægning af forbindelsen mellem gentagelser, der var nødvendige for at konstruere lange arrays af fortællinger med evnen til teoretisk at adressere enkelte steder i genomet. Ud over deres rolle i at lette HDR (homolog direkte rekombination) tillader stedsspecifikke nukleaser også hurtig generering af cellelinjer og organismer med nulfænotyper; NHEJ-medieret reparation af en nuklease-induceret DSB fører til introduktion af små indsættelser eller sletninger på det målrettede sted, hvilket resulterer i knockout af genfunktion via rammeskiftmutationer.

billede taget fra http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/gma/nucleases.aspx

adskilt fra de stedsspecifikke nukleaser beskrevet ovenfor, CRISPR (Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats)/CRISPR-associeret (Cas) system er for nylig opstået som et potentielt let og effektivt alternativ til FNs og TALENs til inducering af målrettede genetiske ændringer. I bakterier giver CRISPR-systemet erhvervet immunitet mod invaderende fremmed DNA via RNA-styret DNA-spaltning. I type II CRISPR / Cas-systemet er korte segmenter af fremmed DNA, betegnet “afstandsstykker” integreret i CRISPR genomic loci og transkriberet og behandlet til kort CRISPR RNA (crrna ‘ er). Disse crrna ‘er annealer til transaktiverende crrna’ er (tracrrna ‘ er) og direkte sekvensspecifik spaltning og lyddæmpning af patogen DNA af CAS-proteiner. Nyligt arbejde har vist, at Målgenkendelse af Cas9-proteinet kræver en “frø” – sekvens inden for crRNA og en konserveret dinukleotidholdig protospacer tilstødende motiv (PAM) sekvens opstrøms for crRNA-bindende region. CRISPR / Cas-systemet kan derved målrettes mod at spalte stort set enhver DNA-sekvens ved at omdesigne crRNA. Signifikant har CRISPR / Cas-systemet vist sig at være direkte bærbart over for humane celler ved co-levering af plasmider, der udtrykker Cas9-endonukleasen og de nødvendige crRNA-komponenter.

billede taget fra https://www.computescotland.com/crisprcas9-genome-editing-8111.php