strukturelt grundlag for genkendelse af K48-bundet Ub-kæde ved proteasomal receptor Rpn13

K48-bundet Ub-kæde svinger dynamisk blandt flere konformationer

vi brugte smFRET til at vurdere det rumlige arrangement af de to Ub-underenheder i ligandfri K48-diUb. Vi introducerede fluorophorer, Aleksa Fluor 488 og Cy5, ved N-terminalen af den distale Ub og C-terminalen af den proksimale Ub (supplerende Fig. S1a). Ved hjælp af forventningsmaksimeringsalgoritm32 kan smFRET-profilen for K48-diUb bedst beskrives som tre overlappende FRET-arter (supplerende Fig. S2). De høje, mellemstore og lave FRET-arter er centreret ved FRET-effektivitet på 0,74, 0,57 og 0,23 med respektive populationer på ~48, ~39 og ~13% (Fig. 1a). FRET-afstandene mellem fluoroforernes centrum beregnes til henholdsvis ~43, ~50, ~64 liter. Således kan de høje, mellemstore og lave FRET arter tildeles kompakte, halvåbne og åbne tilstande, der allerede eksisterer for K48-diUb.

A med fluorophorer konjugeret ved 76 C-stedet for den proksimale Ub og 0 C af den distale Ub (jf. Supplerende Fig. S1a), kan smFRET-profilen monteres på tre overlappende FRET-arter. Medmindre andet er angivet, anvendes dette par konjugationssteder til alle smFRET-undersøgelser af K48-diUb. Den høje FRET Art (farvet rød) svarer til en allerede eksisterende kompakt tilstand. b – D den kompakte tilstand kan selektivt beriges med rpn13 i fuld længde, og befolkningsforøgelsen kan monteres på en bindende Isoterm. F. eks.kan den kompakte tilstand selektivt beriges med Rpn13NTD, og befolkningsforøgelsen kan monteres som en bindende Isoterm. h med fluorophorerne konjugeret ved n25c / N25C-steder kan Rpn13NTD selektivt berige den allerede eksisterende kompakte tilstand af den distale diUb af K48-tetraUb (jf. Supplerende Fig. S5), der giver en bindende affinitet. Populationerne af smFRET-arten er i gennemsnit over tre uafhængige målinger, med fejlene, der angiver 1 SD; KD-værdierne rapporteres som den bedste pasform til prist-monteringsfejl

konformationsudsving af K48-diUb er tidligere blevet undersøgt ved hjælp af smFRET26. I denne undersøgelse løste forfatterne to smFRET-arter for K48-diUb, nemlig høj-FRET og lav-FRET arter med center FRET effektivitet ved henholdsvis 0,69 og 0,41 ud over en no-FRET Art. Forfatterne viste, at titreringen af en inaktiveret OTUB1 (OTUB1i), en deubikvitinase, der er specifik for K48 isopeptid linkage33, hovedsageligt beriger arten med lav FRET. Deres observation førte til forslaget om, at K48-diUb specifikt kan genkendes af OTUB1 gennem en konformationsvalgmekanisme. Her gentog vi smFRET-titreringen og fandt, at OTUB1i beriger mellem-FRET-arten (supplerende Fig. S3a-c). Desuden kan populationsforøgelsen af medium-FRET-arten ved otub1i-titrering monteres på en bindende Isoterm med en KD-værdi på 7,7 liter 0.1 stk. (supplerende Fig. S3d), som er tæt på KD-værdien tidligere rapporteret26. Således bør mellem-FRET-arten i den foreliggende undersøgelse svare til lav-FRET-arten i den foregående undersøgelse, og uoverensstemmelsen kan opstå fra forskellige fotontællingseffektiviteter og tilpasningsrutiner for smFRET-tidsspor.

for yderligere at bekræfte, at K48-diUb svinger mellem tre allerede eksisterende konformationstilstande, introducerede vi fluoroforer ved yderligere par fluoroforkonjugationssteder (supplerende Fig. S1b-d). For de alternative steder, selvom CENTEREFFEKTIVITETEN af FRET-arten er forskellig, kan smFRET-profilerne stadig beskrives som tre overlappende FRET-arter med lignende populationer (supplerende Fig. S4). For eksempel for 25 C/25 C konjugationssteder er høj -, mellem-og lav-FRET-arterne centreret ved FRET-effektivitet på 0,68, 0,54 og 0,21 med respektive populationer på ~48%, ~43% og ~9% (supplerende Fig. S4d). Således er konjugering af fluoroforerne usandsynligt at forstyrre proteinstrukturen, og smFRET-målingerne har afsløret den iboende konformationsdynamik af K48-diUb uanset konjugationsstedet, det vil sige K48-diUb veksler mellem tre forskellige tilstande i fravær af et partnerprotein.

for yderligere at vurdere, om Ub-underenheder i længere K48-bundet Ub-kæde også svinger mellem flere konformationstilstande, analyserede vi smFRET-profilen af K48-bundet tetra-allestedsnærværende (K48-tetraUb). Vi konjugerede fluoroforerne på to n25c-steder i den distale diUb (med respekteret til den proksimale diUb) af K48-tetraUb. SmFRET-profilen kan også passe som tre overlappende FRET-arter (supplerende Fig. S5a). Selvom de relative populationer af de tre arter er forskellige fra en isoleret K48-diUb med fluoroforer konjugeret på samme steder (supplerende Fig. S4d), center FRET effektivitet af FRET arter er næsten identiske. Således bevares diub-enhedens konformationstilstande sandsynligvis i længere K48-bundet Ub-kæde, mens forskellen i de relative populationer kan være et resultat af modulerende virkning af den proksimale diUb.

high-FRET-arten beriges selektivt af Rpn13

for at vurdere forholdet mellem konformationsdynamikken i K48-bundet Ub-kæde og rpn13-genkendelse titrerede vi 150 pM fluorophore-mærket K48-diUb med humant Rpn13-protein i fuld længde. Interessant, ved tilsætning af 100 nM Rpn13, den allerede eksisterende high-FRET arter af K48-diUb er beriget fra ~48% Til ~57% (Fig. 1a, b), mens populationen af Mellem – og lav-FRET arter falder. Populationen af high-FRET arter fortsætter med at stige med mere rpn13 tilføjet (Fig. 1c), og bindingsisotermen kan monteres til en KD-værdi på 119 liter 24 nM (Fig. 1d).

det er tidligere vist,at Rpn13NTD hovedsageligt er ansvarlig for Ub binding6, 7. Således udførte vi smFRET-titrering for 150 pM fluorophore-mærket K48-diUb ved kun at anvende Rpn13NTD, der kun omfatter de første 150 rester. Rpn13NTD beriger også selektivt de høje FRET arter af K48-diUb (Fig. 1e, f). Befolkningsforøgelsen af arter med høj bånd kan monteres for at give en KD-værdi på 33,1 liter 6,9 nM (Fig. 1g), hvilket er omkring 4 gange stigning i affinitet sammenlignet med rpn13 i fuld længde. Hvis fluoroforerne er fastgjort på alternative konjugationssteder (supplerende Fig. S1B og S4b) forårsager titrering af Rpn13NTD også berigelsen af ækvivalente FRET-arter efter en lignende tendens, hvilket giver næsten identisk KD-værdi (supplerende Fig. S6). Således kan udseendet yderligere rester have en lille hæmmende virkning på interaktionen mellem Rpn13NTD og K48-diUb.

desuden udførte vi smFRET-titrering for 150 pM K48-tetraUb med fluoroforer konjugeret ved den distale diUb (supplerende Fig. S5a). Titrering af Rpn13NTD beriger selektivt de allerede eksisterende high-FRET arter af den fluorophore-mærkede distale diUb (supplerende Fig. S5b-d), og bindingsisotermen kan monteres til en KD-værdi på 214 liter 70 nM (Fig. 1 time). Den 7 gange reduktion i bindingsaffinitet sammenlignet med Rpn13ntd: K48-diUb-interaktion kan tilskrives selvforeningen mellem distal diUb og proksimal diUb34, hvilket gør bindingsoverfladen mindre tilgængelig for rpn13-binding. Det er vigtigt, at for alle smFRET-titreringer af K48-diUb eller K48-tetraUb ændrer centereffektiviteten af high-FRET-arten lidt i fravær eller tilstedeværelse af Rpn13 eller Rpn13NTD. Dette betyder, at Rpn13 binder til en allerede eksisterende konformation af K48-diUb gennem en konformationsvalgmekanisme, hvad enten K48-diUb er i sig selv eller en del af længere Ub-kæde. Det betyder også, at den høje FRET-art, dvs.den allerede eksisterende kompakte tilstand af K48-diUb, ikke er helt lukket og er klar til at interagere med andre proteiner. Det er vigtigt, at den selektive berigelse af high-FRET-arten også indikerer, at Rpn13 skal interagere med begge Ub-underenheder på samme tid.

Rpn13 binder fortrinsvis til K48-bundet diUb

for at vurdere rpn13-bindingsspecificitet for K48-binding vurderede vi bindingsaffiniteten mellem Rpn13 og andre typer Ub-proteiner. Med titreringen af 200 nM Rpn13NTD i 150 pM fluorophore-mærket K48-diUb øges populationen af højfret-arten med 15% fra ~48% Til ~63% (Fig. 1f). Ved denne koncentration er K48-diubbinding endnu ikke mættet med Rpn13NTD (Fig. 1g) og derfor er populationen af high-FRET-arten følsom over for lille ændring af den tilgængelige rpn13ntd-koncentration. Umærket K48-diUb kan konkurrere om bindingen til Rpn13NTD med fluoroformærket K48-diUb. Med tilsætningen af 150 pM umærket K48-diUb falder populationen af de høje FRET-arter med 7,5%, svarende til en 50% inhibering af rpn13ntd-bundet fluorophore-mærket K48-diUb (Fig. 2a). Med tilsætningen af 300 pM umærket K48-diUb falder populationen af arter med høj bånd med 11%, hvilket svarer til i alt 73% hæmning (Fig. 2b). Som sådan konkurrerer både fluoroformærket og umærket K48-diUb om den samme bindingsgrænseflade på Rpn13 med lignende bindingsaffinitet. Dette betyder også, at konjugering af fluoroforerne til K48-diUb forårsager ringe forstyrrelse af interaktionen mellem Rpn13NTD og K48-diUb.

A, B tilsætning af 200 nM Rpn13NTD beriger først de høje FRET arter af fluorophore-mærket K48-diUb (jf. Figur 1F), og yderligere tilsætning af 150 pM og 300 pM umærket K48-diUb mindske bestanden af høj-FRET arter. c, D tilsætning af 150 pM og 300 pM umærket Ub monomer har ubetydelig virkning på populationen af de høje FRET arter. e, F tilsætning af 150 pM K48-diUb og 150 pM M1-diUb forårsager meget lille fald i befolkningen i high-FRET-arten

desuden tilføjede vi til blandingen af 200 nM Rpn13NTD og 150 pM fluorophore-mærket K48-diUb umærket Ub monomer, K63-bundet diubikitin eller M1-bundet diubikitin for at vurdere, om andre typer Ub kan fortrænge K48-diUb. Populationen af de høje FRET arter ændrer sig lidt med tilføjelsen af 150 pM eller 300 pM Ub monomer (Fig. 2c, d). Med tilføjelsen af 150 pM K63-diUb og 150 pM M1-diUb er populationen af high-FRET-arten også uændret inden for fejlområdet (Fig. 2e, f). På den anden side forårsager direkte titrering af 1 liter rpn13ntd i fluorophore-konjugeret K63-diUb og M1-diUb ringe ændring i deres allerede eksisterende smFRET-profiler (supplerende Fig. S7). Sammen interagerer Rpn13NTD selektivt med K48-diUb.

opløsning struktur af Rpn13NTD:K48-diUb kompleks

selvom vi nu har vist rpn13ntd selektivt interagerer med K48-diUb, er kun den komplekse struktur mellem Rpn13NTD og Ub monomer blevet bestemt6,8. For at forstå, hvordan de to underenheder i K48-diUb samtidig kan interagere med Rpn13NTD, satte vi os for at bestemme opløsningsstrukturen for Rpn13NTD:K48-diUb-kompleks ved hjælp af nuklear magnetisk resonans (NMR). Efter dannelsen af proteinkompleks ville grænsefladerester opleve forskellige lokale omgivelser og derfor vise NMR-signaler. Vi fandt ud af, at titrering af umærket K48-diUb til 15N-mærket Rpn13 forårsager store kemiske skiftforstyrrelser (CSP ‘ er), som hovedsageligt involverer rester 73-83 og 93-106 (Fig. 3a). Disse rester danner en sammenhængende overflade på Rpn13, dækker et område større end forventet fra den tidligere bestemte komplekse struktur mellem Rpn13NTD og Ub monomer6,7. På den anden side titreres umærket Rpn13NTD til K48-dUb, med enten proksimal eller distal Ub 15N-mærket og den anden underenhed umærket, observeres CSP ‘ erne hovedsageligt for rester i det primære arkområde for begge Ub-underenheder. Nogle af de grænsefladerester forsvandt også ved dannelsen af komplekset (Fig. 3b, c).

a-c CSP gennemsnit over 1H og 15N dimensioner af backbone amid protoner ved dannelsen af komplekset med 0,2 mM isotopmærkede og umærkede proteiner. Indsatser: den 15N-mærkede underenhed er illustreret med overfladerepræsentation, og de rødfarvede rester har CSP ‘ er over den stiplede linje. d, e med en paramagnetisk sonde konjugeret på e24c-stedet for den distale Ub, intensitetsforholdene mellem paramagnetiske og diamagnetiske spektre, og præ-Pri2-værdierne blev vurderet for rygradamidprotoner af 15N-mærket Rpn13NTD. Grå kasser angav rester med meget store intermolekylære PREs. f med den paramagnetiske sonde konjugeret på n25c-stedet for den proksimale Ub, blev der målt Kurs2-værdier for amidprotoner af 15N-mærket distal Ub i K48-diUb. Fejlbjælkerne angiver 1 S. D., og rester, der er fuldstændigt udvidet i komplekset, betegnes med stjerner

Nuclear Overhauser effect (NOE) rapporterer afstandsforhold (<6 liter) mellem kerner. Desuden kan 13C halvfiltreret NMR-eksperiment tilvejebringe NOE mellem 12c-bundet proton og 13C-bundet proton, dvs.intermolekylært afstandsforhold. Vi opnåede intermolekylære Noe ‘ er mellem Rpn13NTD og den proksimale Ub, mellem Rpn13NTD og den distale Ub og mellem proksimal Ub og distal Ub (supplerende Fig. S8). Desuden konjugerede vi en maleimid-EDTA-MN2+ paramagnetisk sonde på E24C-stedet for den distale Ub og indsamlede paramagnetisk afslapningsforbedring (PRE) for rygradamidprotoner af Rpn13NTD efter den etablerede protokol22, 35. Som vurderet enten ved topintensitetsforhold for paramagnetiske versus diamagnetiske spektre eller ved tværgående afslapningsforbedringslys2-hastighed oplever rpn13-rester 30-42 og 101-106 store PREs med svær linjeudvidelse (Fig. 3d, e). Vi konjugerede også den paramagnetiske sonde på n25c-stedet for den proksimale Ub, og evaluerede den tværgående afslapningsforbedringshastighed Kurt2 for den distale Ub (Fig. 3f). Store PRÆVÆRDIER observeres mellem de to Ub-underenheder i den ligandfrie K48-diUb, og tilsætningen af Rpn13NTD øger inter-Ub PREs, men med en lignende PRÆPROFIL. PRE NMR-eksperimenterne bekræfter således, at Rpn13NTD beriger den allerede eksisterende kompakte tilstand af K48-diUb.

at forfine rpn13ntd:K48 – diub kompleks struktur mod eksperimentelle begrænsninger, vi udførte stiv kropsdocking med torsionsvinkelfrihed givet til diub linkerresterne og til sidekæderne af grænsefladerester. For de 20 lavest energi-konformere er rod-middel-kvadratisk (RMS) afvigelse for rygradstunge atomer af alle stive rester 0,86 liter 0,54 liter (supplerende Fig. S9 og tabel S1). De to Ub-underenheder af K48-diUb forbliver forbundet i det komplekse, begrave opløsningsmiddel tilgængeligt overfladeareal (SASA) på ~1130 liter 2. På den anden side kiler Rpn13NTD sig ind og begraver ~940 liter 2 af SASA med den proksimale Ub og ~1300 liter 2 af SASA med den distale Ub (Fig. 4a). Den komplekse struktur mellem Rpn13NTD og proksimal Ub af K48-diUb i den foreliggende undersøgelse svarer til den kendte komplekse struktur mellem Rpn13NTD og Ub monomer6,7, med RMS-forskellen for rygradstunge atomer 2,17 purpur 0,31 Purpur (supplerende Fig. S10a). Interessant, selvom de hydrofobe rester L8, I44 og V70 i den proksimale Ub er involveret i interaktion med Rpn13, de samme tre rester i den distale Ub er begravet i Ub-Ub-interface.

en struktur af Rpn13NTD: K48-diub kompleks. Dannelse af komplekset begraver omfattende grænseflader mellem underenhederne. B elektrostatiske potentielle overflader af Rpn13NTD og distal Ub af K48-diUb, trukket i en skala på 3 kbt. Rester R104 i Rpn13NTD og D39 i distal Ub er vist som kugler og pinde. c R104E charge-reversering mutation i Rpn13NTD forårsager et 300 gange fald i bindingsaffiniteten for K48-diUb, som vurderet af smFRET (jf. Supplerende Fig. S11). KD-værdien er rapporteret som bedste pasform til justering af justeringsfejl. d vestlige blot-analyser viser, at transfektionen af rpn13 R104E-mutant (med et N-terminal flag) øger den samlede mængde K48-bundne polyubproteiner i cellen. e-Celleviabiliteter ved varmechok (i forhold til celler uden varmechok) viser, at transfektion af rpn13 R104E-mutant, men ikke af vildtype Rpn13, giver termotolerance. * P < 0, 05, ***P < 0.001, til kontrol af celler i samme gruppe, uparret t-test; # # P < 0,01, # # # P < 0,001, til de ubehandlede celler med varmechok, envejs ANOVA; & &P < 0.01, &&&P < 0.001, til vildtype Rpn13 transficerede celler med varmechok, envejs ANOVA

rpn13ntd: K48-diUb kompleks struktur kan også bekræftes af enkeltmolekylære FRET data. Baseret på den komplekse struktur modellerede vi fluoroforerne på deres konjugationssteder i K48-diUb. Den gennemsnitlige afstand er 43,2 l 5.8 liter mellem de geometriske centre af fluorophore aromatiske ringe, hvilket svarer til en teoretisk FRET effektivitet på 0,73 liter 0,13 (supplerende Fig. S10b). Denne værdi er næsten den samme som den centereffektivitet, der observeres for de høje FRET-arter (Fig. 1a).

forstyrrelse af Rpn13NTD: distal Ub-interaktion forårsager akkumulering af allestedsnærværende proteiner i celle

i den komplekse struktur mellem Rpn13NTD og K48-diUb svarer interaktionen mellem Rpn13NTD og den proksimale Ub som tidligere rapporteret (supplerende Fig. S10a). Således designede vi eksperimenter for at vurdere funktionel betydning for interaktionen mellem Rpn13NTD og den distale Ub af K48-diUb. Mange ladede rester er placeret ved grænsefladen mellem Rpn13NTD og den distale Ub af K48-diUb, og derfor kan elektrostatisk kraft spille en vigtig rolle for stabilisering af komplekset (Fig. 4b). Blandt dem er Rest D39 i den distale Ub tæt på Rest R104 i Rpn13. Vi muterede således rpn13-rest R104 til et glutamat og titrerede den mutante Rpn13NTD til fluorofor-mærket K48-diUb. Det mutante protein beriger de høje FRET arter af K48-diUb (supplerende Fig. S11). Bindingsaffiniteten bliver imidlertid meget svagere. Bindingsisotermen kan monteres på en KD-værdi på 10,0 liter 3,3 liter, cirka 300 gange svagere end vildtype Rpn13NTD (Fig. 4c). Som sådan er forbindelsen med den distale Ub vigtig for den specifikke genkendelse mellem Rpn13 og K48-diUb.

den nedsatte bindingsaffinitet af r104e-mutanten tillod os at vurdere den funktionelle betydning af interaktionen mellem Rpn13 og K48-bundet Ub-kæde. Transient transfektion af vildtype Rpn13 øger lidt mængden af K48-bundne polyubproteiner (Fig. 4d). Det er muligt, at ved rpn13-transfektion konkurrerer en overskydende mængde fri Rpn13 om binding til de K48-bundne polyubproteiner med proteasom-associeret Rpn13, hvilket gør rekrutteringen af allestedsnærværende substratproteiner til proteasomet mindre effektiv. På den anden side øger transfektionen af rpn13 R104E-mutant i høj grad mængden af K48-bundne polyubproteiner sammenlignet med cellerne transficeret med vildtype Rpn13 (Fig. 4d). Som en positiv kontrol inkuberede vi cellerne med 1 liter mg132, en potent proteasominhibitor36. På grund af blokering af nedbrydning af labile proteiner øger tilsætning af MG132 signifikant mængden af K48-bundne polyubproteiner. Samlet set kan R104E-mutation af Rpn13 føre til akkumulering af allestedsnærværende substratproteiner. Dette kan tilskrives svagere interaktion mellem proteasom-associeret rpn13-mutant og K48-diUb og K48-poyUb.

varmechok kan nedsætte cellens levedygtighed. Vi fandt ud af, at 30 min varmechok ved 43 liter C kan reducere levedygtigheden af HEK293 celler til 75%. I lighed med de tidligere rapporter36,37 fandt vi også, at behandlingen af MG132 har en beskyttende virkning på celleoverlevelse ved varmechok, med cellelevedygtighed faldet til ~90% (Fig. 4e). Dette skyldes, at MG132 hæmmer proteasomal nedbrydning, hvilket gør de ellers kortlevende varmechokproteiner mere tilgængelige (Fig. 4d). Vi analyserede også levedygtigheden af varmechokede celler transficeret med vildtype Rpn13, og fandt ingen signifikant forskel fra kontrolcellerne uden rpn13 transfektion. På den anden side faldt cellelevedygtigheden af rpn13 R104E transficerede celler til ~83% ved varmechok, hvilket er signifikant højere end for kontrolceller og celler transficeret med vildtype Rpn13 (Fig. 4e). Dette indebærer, at mutanten Rpn13 har en beskyttende virkning på celleoverlevelse ved varmechok, svarende til effekten af MG132. Samlet set er interaktionen mellem Rpn13 og K48-bundet Ub-kæde essentiel for rpn13-medieret genkendelse af allestedsnærværende substratproteiner af proteasomet, mens en grænseflademutation i Rpn13 kan forårsage akkumulering af visse substratproteiner, såsom varmechokproteiner, og giver de transficerede celler termotolerance.

Rpn13NTD:K48-diUb-interaktion kan målrettes mod at modulere rpn13-funktion

Rpn13 rekrutteres dynamisk til proteasomet via interaktionen mellem Rpn13NTD og den C-terminale hale af Rpn27,13. Den komplekse struktur indikerer her, at bindingsgrænsefladen på Rpn13NTD for Rpn2 er tæt på, men ikke overlapper med bindingsgrænsefladen for den distale Ub af K48-diUb (Fig. 5a). Vi forblandede således de sidste 16 rester af Rpn2 (Rpn2CTD) med Rpn13NTD eller med rpn13 i fuld længde i forholdet 1:1 og titreret Rpn13NTD:Rpn2CTD-kompleks til fluorophore-mærket K48-diUb. Forblandingen af Rpn2CTD øgede KD-værdien af Rpn13NTD: K48-diUb fra 33,1 liter 6,9 nM (Fig. 1g) til 66,8 liter 13,9 nM (supplerende Fig. S12a-c og Fig. 5b), mens faldt KD-værdien af Rpn13:K48-diUb fra 119 liter 24 nM (Fig. 1d) til 43,9 liter 12,8 nM (supplerende Fig. S12d – F og Fig. 5c). Ved at tilvejebringe måleusikkerhederne forårsager associeringen af Rpn2CTD således kun lille forstyrrelse for bindingsaffiniteten mellem Rpn13 og K48-diUb, hvilket også kan have at gøre med tilstedeværelsen af linker og det C-terminale domæne af Rpn13.

a bindingsoverfladen af den distale Ub af K48-diUb på Rpn13NTD støder op til bindingsoverfladen af Rpn2CTD. Med rpn13ntd-Rpn2CTD kompleks struktur (PDB kode 5V1Y) overlejret af Rpn13NTD, er Rpn2CTD vist som rød tegneserie. Rpn13 rest K34 er tæt på C-terminalen af distal Ub (vist som en stiplet linje). b, C-Bindingsaffiniteter blev opnået fra smFRET-titreringer af ækvimolær Rpn13NTD:Rpn2CTD eller Rpn13:Rpn2CTD til fluoroformærket K48-diUb. KD-værdierne indberettes som fejl i den bedst egnede tilpasning. D Binding af Rpn2-forankret Ub-monomer indtager sandsynligvis den samme bindingsoverflade af den distale Ub, hvilket forårsager forskydningen af sidstnævnte. e, f smFRET-konkurrenceforsøgene med yderligere tilsætning af 150 pM Rpn2CTD-Ub-fusionsprotein til blandingen af 200 nM Rpn13NTD eller Rpn13 i fuld længde og 150 pM fluorophore-mærket K48-diUb (c.F. figur 1c og f). Fejlen angiver 1 S. D. fra tre uafhængige målinger af populationerne af smFRET-arten

Rpn2 og distal Ub af K48-diUb optager nærliggende overflader på Rpn13NTD. Derfor kan et fusionsprotein med Ub-monomer vedhæftet ved C-terminalen af Rpn2CTD stikke ud og forstyrre interaktionen mellem Rpn13NTD med den distale Ub af K48-diUb (Fig. 5d). Som vi har vist, tilsætning af 200 nM Rpn13NTD øger populationen af høj-FRET arter af 150 pM fluorofor-mærket K48-diUb til ~63% (Fig. 1f), mens tilsætning af Ub-monomer ikke kan konkurrere om rpn13ntd-binding (Fig. 2c, d). Da vi tilføjede yderligere 150 pM umærket Rpn2CTD-Ub fusionsprotein, falder populationen af high-FRET arter med ~4% til ~59% (Fig. 5e). På den anden side har vi vist, at tilsætning af 200 nM Rpn13 i fuld længde øger bestanden af de høje FRET-arter på 150 pM fluorophore-mærket K48-diUb til ~60% (Fig. 1c). Yderligere tilsætning af 150 pM umærket Rpn2CTD-Ub fusionsprotein reducerer populationen af high-FRET arter med ~4,5 til ~55,5% (Fig. 5f). Bemærk, at tilføjelse af en Ub ved Rpn2CTD næsten ikke har nogen effekt på interaktionen mellem Rpn2CTD og Rpn13NTD (supplerende Fig. S13). Således indikerer vores data, at rpn2 og K48-diUb bindende grænseflader på Rpn13NTD er tæt på hinanden. Endnu vigtigere er, at Rpn2-forankret Ub fysisk kan blokere adgangen til den distale diUb til Rpn13 og svække interaktionen mellem K48-diUb og Rpn13.