Bewertung der Anwendung des Ka / Ks-Verhältnistests auf alternativ gespleißte Exons

Zusammenfassung

Zusammenfassung: Kürzlich wurde der Ka / Ks-Verhältnistest vorgeschlagen und erfolgreich in Genomanmerkungen von Eukaryoten eingesetzt, der die Proteinkodierungspotentiale genomischer Regionen anhand ihrer nicht-synonymen zu synonymen Divergenzraten bewertet. Wir führten systematisch den Ka / Ks-Verhältnistest an 925 transkriptbestätigten alternativ gespleißten Exons im menschlichen Genom durch, die wir in diesem Manuskript beschreiben. Wir fanden heraus, dass 22,3% der evolutionär konservierten alternativ gespleißten Exons den Ka / Ks-Verhältnistest nicht bestehen können, verglichen mit 9,8% für konstitutive Exons. Die falsch negative Rate war die höchste (85,7%) für Exons mit niedrigen Transkripteinschlussfrequenzen. Analysen von alternativ gespleißten Exons, die durch mRNA-Sequenzen voller Länge unterstützt wurden, ergaben ähnliche Ergebnisse, und fast die Hälfte der Exons, die an alternativen Spleißereignissen der Vorfahren beteiligt waren, konnte diesen Test nicht bestehen. Unsere Analyse schlägt eine zukünftige Richtung vor, um vergleichende Genomik-basierte alternative Spleißvorhersagen mit dem Ka / Ks-Verhältnistest in höheren Eukaryoten mit umfangreichem RNA-alternativem Spleißen zu integrieren.

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1 EINLEITUNG

Die vergleichende Genomik hat leistungsstarke Werkzeuge für die Annotation eukaryotischer Genome bereitgestellt (Kellis et al., 2003). In einer bahnbrechenden Studie haben Nekrutenko et al. (2002) schlugen den ‚Ka / Ks-Verhältnistest‘ vor, um die proteinkodierenden Potentiale vorhergesagter Exons zu bewerten. Dieser Test basiert auf der Annahme, dass die Mehrheit der proteinkodierenden Regionen im menschlichen Genom während der Evolution einer starken reinigenden Selektion unterliegt. Infolgedessen übersteigen ihre Raten der synonymen Divergenz (Ks) bei weitem die Raten der nicht-synonymen Divergenz (Ka), was Ka / Ks–Verhältnisse von viel weniger als eins in orthologen Sequenzvergleichen zwischen Mensch und Maus ergibt. An einer Stichprobe von 1244 Exons aus 153 proteinkodierenden Genen ergab der Ka / Ks-Verhältnistest eine falsch negative Rate von 8% und eine falsch positive Rate von < 5% für interne Exons, eine Genauigkeit, die besser war als die meisten Genvorhersagewerkzeuge (Nekrutenko et al., 2002). Seit seiner Einführung wurde der Ka / Ks-Verhältnistest weit verbreitet und erfolgreich zur Verbesserung der Annotationen menschlicher und anderer Säugetiergenome eingesetzt (Miller et al., 2004; Nekrutenko, 2004; Nekrutenko et al., 2003b; Zhang und Gerstein, 2004).

Eine aufkommende Frage zum Ka/Ks-Verhältnistest bezieht sich auf alternativ gespleißte Exons in den eukaryotischen Genomen. Neuere Studien von exprimierten Sequenzen und Microarray-Daten haben gezeigt, dass alternatives Spleißen ein weit verbreiteter Mechanismus der Genregulation in höheren Eukaryoten ist (Lareau et al., 2004; Modrek und Lee, 2002). Bis zu drei Viertel der menschlichen kodierenden Gene werden alternativ gespleißt (Johnson et al., 2003). Es gibt zahlreiche Hinweise darauf, dass alternatives Spleißen mit einer Entspannung des Selektionsdrucks während der Evolution verbunden ist (Boue et al., 2003). Zum Beispiel wird beobachtet, dass alternatives Spleißen mit einer beschleunigten Rate der Exonbildung und des Verlusts verbunden ist (Modrek und Lee, 2003), neue Exonentstehung aus Alu-Elementen (Sorek et al., 2002), Toleranz vorzeitiger Terminierungscodons (Lewis et al., 2003; Xing und Lee, 2004) und so weiter. Iida und Akashi (2000) untersuchten die Sequenzdivergenzmuster von 110 alternativ gespleißten proteinkodierenden Genen aus Mensch und Drosophila und fanden heraus, dass alternativ gespleißte Regionen dieser Gene im Vergleich zu konstitutiven Regionen höhere Ka / Ks-Werte aufwiesen. Andere Beispiele für erhöhte Ka / Ks in alternativ gespleißten Exons wurden ebenfalls berichtet (Filip und Mundy, 2004; Hurst und Pal, 2001). Diese Beobachtungen werfen eine Frage bezüglich der Abweichung vom Ka / Ks-Verhältnistest unter alternativ gespleißten Exons auf.

2 METHODEN

Wir identifizierten alternativ gespleißte Exons, indem wir human exprimierte Sequenzen an das menschliche Genom ausrichteten (Modrek et al., 2001). Um den Grad des alternativen Spleißens für jedes alternativ gespleißte Exon zu quantifizieren, verwendeten wir eine Standardmetrik des alternativen Spleißens — das Exon-Einschlussniveau, definiert als die Anzahl der ESTs, die ein Exon enthielten, dividiert durch die Gesamtzahl der ESTs, die dieses Exon entweder enthielten oder übersprangen. Wir haben alternativ gespleißte Exons basierend auf ihren Einschlussniveaus in drei Klassen unterteilt: Hauptform (> 2/3), Mittelform (zwischen 1/3 und 2/3) und Nebenform (< 1/3).

Wir identifizierten die orthologe Exonsequenz für jedes menschliche Exon in der genomischen Sequenz des Maus-Ortholog, wie zuvor beschrieben (Modrek und Lee, 2003). Für jedes orthologe Exonsequenzpaar von Mensch und Maus führten wir den Ka / Ks-Verhältnistest nach dem Protokoll von Nekrutenko et al. (2003a). Kurz gesagt, orthologe Exonsequenzen von Mensch und Maus wurden übersetzt und dann unter Verwendung von CLUSTALW Thompson et al., 1994 unter Default-Parameter. Diese Proteinausrichtung wurde verwendet, um eine Ausrichtung entsprechender Nukleotidsequenzen zu säen, und Lücken in der Ausrichtung wurden getrimmt. Wir schätzten die Anzahl der synonymen und nicht-synonymen Substitutionen / Sites unter Verwendung der Yang–Nielsen-Schätzungen aus dem yn00-Programm des PAML-Pakets (PAML 3.14) (Yang, 1997). Wir erstellten eine 2 × 2-Kontingenztabelle unter Verwendung der Anzahl der geänderten und unveränderten synonymen / nicht-synonymen Stellen und testeten, ob das Ka / Ks-Verhältnis signifikant < 1 war, indem wir den exakten Fisher-Test verwendeten. Wir definierten ein Exon als Bestehen des Ka / Ks-Verhältnistests, wenn sein Ka / Ks signifikant < 1 auf dem P < 0,05-Niveau betrug.

3 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Wir haben eine Liste von 925 humanen alternativ gespleißten Exons zusammengestellt, die zwischen humanen und Mausgenomen konserviert wurden, basierend auf Analysen von humanen exprimierten Sequenzen (Modrek et al., 2001). Wir haben auch eine Liste von 10 996 menschlichen konstitutiven Exons als Kontrolle zusammengestellt. Alle diese Exons waren interne Exons, die an beiden Enden von Introns flankiert wurden. Wir führten die Ka / Ks-Verhältnistests an diesen Exons nach dem Protokoll von (Nekrutenko et al., 2003a) (siehe Abschnitt Methoden). Von den konstitutiven Exons 9.8% bestanden den Ka / Ks-Verhältnistest nicht, ein Verhältnis ähnlich dem, was in der ersten Studie berichtet wurde (8%) (Nekrutenko et al., 2002) (Tabelle 1). Im Gegensatz dazu konnten 22,3% der getesteten alternativ gespleißten Exons den Ka / Ks-Verhältnistest nicht bestehen, eine mehr als 2-fache Zunahme im Vergleich zu konstitutiven Exons. Weil alternativ gespleißte Exons mit unterschiedlichen Exoneinschlussniveaus (siehe Definitionen im Abschnitt Methoden) unterschiedliche Muster evolutionärer Divergenz aufwiesen (Modrek und Lee, 2003; Pan et al., 2004, teilten wir die 925 alternativ gespleißten Exons basierend auf ihren Exon-Einschlussniveaus in drei Klassen ein (siehe Abschnitt Methoden). Der Anteil der Exons, die den Test nicht bestanden, betrug 16,0% für Major-Form-Exons und stieg auf 85,7% für Minor-Form-Alternative-Exons (eingeschlossen < 1/3 in den Transkripten). Da alternativ gespleißte Exons im Durchschnitt kürzer waren , haben wir auch Exons nach ihrer Größe unterteilt (Abb. 1). Sowohl in konstitutiven als auch in alternativ gespleißten Exons, Die Fraktionen, die den Test nicht bestanden, waren für kürzere Exons höher, im Einklang mit der ursprünglichen Studie Nekrutenko et al., 2002. Der Anteil war jedoch in alternativ gespleißten Exons nach Kontrolle der Exongrößen konstant höher (z. B. 5,4% für konstitutive Exons und 16,6% für alternativ gespleißte Exons zwischen 101 und 150 nt; Abb. 1). Analysen von Maus-gespleißten Exons in einem Maus–Mensch-Vergleich ergaben ähnliche Ergebnisse (Daten nicht gezeigt).

Unser Ergebnis zeigt, dass ein signifikant höherer Anteil alternativ gespleißter Exons im menschlichen Genom den Ka / Ks-Verhältnistest nicht bestehen kann. Dies führt jedoch nicht sofort zu einer erhöhten falsch negativen Rate des Ka / Ks-Verhältnistests in alternativ gespleißten Exons, da andere Interpretationen möglich sind. Implizieren diese Daten tatsächlich, dass eine beträchtliche Anzahl von alternativ gespleißten Exons, die in den menschlichen EST-Sequenzen beobachtet wurden, keine echten Exons darstellen, sondern tatsächlich von Artefakten in den EST-Daten stammen (z. B. seltene Spleißosomenfehler) (Modrek und Lee, 2002; Sorek und Safer, 2003)? Diese Erklärung scheint besonders plausibel für kleinere Form Exons (die in einem kleinen Bruchteil der EST-Sequenzen beobachtet werden). Um diese Möglichkeit zu testen, analysierten wir eine Teilmenge von alternativ gespleißten Exons, die von mRNA-Sequenzen voller Länge unterstützt wurden. Wir beobachteten ähnliche Fraktionen von alternativ gespleißten Exons, die den Ka / Ks-Verhältnistest nicht bestanden (Tabelle 2). Daher können falsche Exons, die von EST-Artefakten stammen, unsere Daten nicht erklären. Stellen alternativ gespleißte Exons, die den Ka / Ks-Verhältnistest nicht bestehen, weitgehend nicht funktionelle Spleißformen dar? Um diese Frage zu beantworten, beschränkten wir unsere Analyse auf einen Satz von 120 Exons, die abwechselnd in Transkriptomen von Mensch und Maus gespleißt wurden. Ein solches Muster des ‚angestammten alternativen Spleißens‘ wurde weithin als Kriterium für funktionelle alternative Spleißereignisse angenommen (Resch et al., 2004; Sorek et al., 2004a). In diesen Exons konnten sogar noch höhere 49,2% (gegenüber 22,3% aller alternativ gespleißten Exons) den Ka / Ks-Verhältnistest (Tabelle 1) nicht bestehen, was mit einer anderen kürzlich durchgeführten Studie zu solchen Exons übereinstimmt (Ohler et al., 2005). Daher kann die Hypothese für nicht funktionale Spleißformen auch unsere Daten nicht erklären. Um den möglichen Einfluss von CpG-Inseln auszuschließen, berechneten wir schließlich die Häufigkeit von CpG über GpC in jedem Exon und beschränkten unsere Analyse auf eine Teilmenge alternativ gespleißter Exons, deren CpG / GpC-Verhältnisse < 0,8 waren (Iida und Akashi, 2000). Von diesen Exons konnten 20,8% diesen Test nicht bestehen, ähnlich wie der Prozentsatz für den gesamten Satz alternativ gespleißter Exons (Tabelle 1). Obwohl im Prinzip ein erhöhtes Ka / Ks-Verhältnis verschiedene zugrunde liegende Mechanismen widerspiegeln könnte , was nicht der Schwerpunkt dieses Manuskripts ist, zeigen unsere Kontrollanalysen, dass ein großer Teil der funktionellen alternativen Exons im menschlichen Genom den Ka / Ks-Verhältnistest nicht besteht.

In den meisten proteinkodierenden Genen gibt es mehr konstitutive Exons als alternativ gespleißte Exons. Da in vielen Organismen die Transkriptsequenzabdeckung (z. B. ESTs) immer noch recht gering ist, ist der Ka / Ks-Verhältnistest ein leistungsfähiges Werkzeug zur Verfeinerung von computergestützten Genstrukturvorhersagen. Die Mehrheit der säugetierproteinkodierenden Gene ist jedoch alternativ gespleißt, und eine kleine Anzahl alternativ gespleißter Exons könnte tiefgreifende funktionelle und regulatorische Auswirkungen haben, wie kürzlich durch das alternative Spleißen der C2A-Domäne von Piccolo (Garcia et al. 2004) und viele andere. Unsere Analyse legt nahe, dass es bei Organismen mit umfangreichem alternativem Spleißen (z. B. Säugetieren) vorzuziehen ist, den Ka / Ks-Verhältnistest mit anderen Metriken zu kombinieren, die die Wahrscheinlichkeit eines alternativen Spleißens anzeigen. Glücklicherweise hat die evolutionäre Genomik auch die typischen Merkmale funktioneller alternativ gespleißter Exons beleuchtet , die erfolgreich in Vorhersagen verwendet wurden (Philipps et al., 2004; Sorek et al., 2004b; Yeo et al., 2005). Solche Informationen können in den Ka / Ks-Verhältnistest integriert werden, um eine genauere Beurteilung der proteinkodierenden Potentiale genomischer Regionen zu ermöglichen.

Die Autoren danken Anton Nekrutenko für die Lektüre unseres Manuskripts und für die hilfreichen Kommentare. Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIH Grant U54-RR021813, ein Lehrer-Scholar Award an C.J.L. von der Dreyfus-Stiftung, ein DOE Grant DE-FC02-02ER63421. Y.X. wird durch ein Ph.D. Dissertationsstipendium der UCLA unterstützt.

Interessenkonflikt: keine Angabe.