Mit der DBE-Technik sammelten wir systematisch Biopsien aus dem gesamten menschlichen Darmtrakt und charakterisierten die Verteilung von enteroendokrinen K- und L-Zellen und die Expression ihrer Hormonprodukte bei gesunden Personen und Personen mit Typ-2-Diabetes.
Da Typ-2-Diabetes Übergewicht / Adipositas und dysfunktionale Glukosehomöostase impliziert, die mit Veränderungen in den enteroendokrinen K- und L-Zellen korrelieren könnten, sollte die Studie das Verteilungsmuster dieser Zellen und die Expression einiger ihrer Produkte in den beiden prospektiv rekrutierten, ähnlich großen, gut definierten und aufeinander abgestimmten Gruppen von Freiwilligen ohne bekannte gastrointestinale Störungen beschreiben. Mit DBE konnte eine hohe Anzahl von Proben im gesamten Darmtrakt gewonnen werden: aus neun anatomisch spezifischen Regionen (Abb. 1) und 7-22 ‚Stationen‘ entlang Jejunum und Ileum. Die Biopsien aus den anatomisch gut definierten Bereichen waren sehr vergleichbar. Größere Unsicherheit besteht hinsichtlich der Biopsiestellen im Jejunum und proximalen Ileum (Biopsiestellen 3-9, Abb. 1) aufgrund der variablen Intubationslänge und damit der Anzahl der zwischen Individuen erhaltenen Proben. Um dieses Problem zu lösen, haben wir Jejunum und Ileum systematisch in sieben Regionen unterteilt (siehe Methoden). Die submuköse Tintenmarkierung, die während der anterograden Enteroskopie bei maximaler Insertionstiefe platziert wurde, wurde während der retrograden Enteroskopie bei vier von 24 Personen beobachtet, was auf eine totale Enteroskopie hinweist (Abb. 2). Es wird angenommen, dass der Großteil des Darmtrakts bei den übrigen Teilnehmern untersucht wurde, gemessen an der Länge der Intubation erreicht (Details siehe unser Methodenpapier ).
Wir verwendeten Immunhistochemie und Zellzahl, um die enteroendokrinen Zellen und Prohormon-verarbeitenden Enzyme zu quantifizieren, und qPCR-mRNA-Expressionsanalyse, um die hormonellen / enzymatischen Produkte zu bewerten. Beide Methoden sind gut etabliert, bringen aber auch Einschränkungen mit sich. Eine hohe Spezifität von Antikörpern, die in der Immunhistochemie verwendet werden, ist von großer Bedeutung, um ein Minimum an unspezifischen Färbungen (falsch positive Ergebnisse) sicherzustellen. Dementsprechend wählten wir Antikörper, die gut etabliert und gut charakterisiert sind . Unter Verwendung der Immunhistochemie und der Zellzahl aus Mikrofotographien von geschnittenen Biopsien werden dreidimensionale Objekte (d. H. enteroendokrine Zellen) mit einer zweidimensionalen Bildgebungstechnik ausgewertet. Eine optimalere Technik zur Bewertung der Zellverteilung wäre die Stereologie, bei der die wahre Dichte (d. H. Zellen / mm3 Gewebe) geschätzt wird . Diese Technik würde jedoch vollständige transversale Gewebeblöcke erfordern, was mit der hohen Anzahl von Biopsiestellen unvereinbar ist, und somit eine detaillierte Kartierung des Darmtrakts bei lebenden Menschen, die in der vorliegenden Studie angestrebt wurde. Darüber hinaus sollte Folgendes berücksichtigt werden. Erstens zeigt die Auswertung der mRNA-Expression die Aktivität endokriner Zellen an, liefert jedoch kein Maß für die Gesamtproduktion eines bestimmten Zellprodukts, da nicht alle mRNA in ein endgültiges aktives Produkt übersetzt werden. Zweitens ist die Expression relativ, da die spezifischen mRNA-Transkripte mit der Expression eines stabil exprimierten Gens verwandt sind (siehe ESM-Methoden für weitere Details). In Anbetracht der biologischen Heterogenität von Typ-2-Diabetes könnten bei einer größeren Stichprobengröße und Einbeziehung von Patienten mit einer umfassenderen Glukosedysregulation möglicherweise ausgeprägtere Unterschiede festgestellt worden sein.
Die Arbeit von Sjölund et al. aus dem Jahr 1983 über die Verteilung enteroendokriner Zellen ist die detaillierteste, die bisher im menschlichen Darm unter Verwendung von IHS mit einer breiten Palette von Antiseren (25 Typen) gegen bekannte oder vorgeschlagene neurohormonelle Darmpeptide durchgeführt wurde . Minimalinvasive Techniken waren zu diesem Zeitpunkt nicht verfügbar. Dementsprechend wurden Proben aus nur sieben Regionen entnommen: proximaler und distaler Zwölffingerdarm, mittleres Jejunum, distales Ileum, Colon ascendens, distaler Teil des Colon transversum oder Sigma und Rektum. Für jede Region wurde Gewebematerial von 9-17 Individuen erhalten. Die Proben wurden entweder während einer Bauchoperation (hauptsächlich aufgrund von Malignität) oder während enteroskopischer Untersuchungen mit Biopsien bei Personen mit ‚anderen gastrointestinalen Störungen‘ entnommen, einschließlich einer Vielzahl von nicht spezifizierten Symptomen und Krankheiten (z. B. ‚okkulte Blutung‘ und ‚Lebererkrankung‘). Im Jahr 1985 verwendeten Adrian et al. eine Radioimmunoassay-Technik, um die Menge an PYY im Magenfundus und Antrum, Zwölffingerdarm, Jejunum, Ileum, Colon ascendens, Sigma und Rektum zu bestimmen . Proben von jedem Standort wurden von 5-8 Personen erhalten, die sich aufgrund von Karzinomen oder Magengeschwüren einer Operation unterzogen. Im Jahr 1992 wurde eine Studie zur Untersuchung der Verteilung enteroendokriner L-Zellen beim Menschen von Eissele et al . Proben wurden aus sieben Regionen gewonnen: Zwölffingerdarm, proximales und distales Jejunum, Ileum, Colon ascendens, Colon transversum und Rektum. Die Proben wurden von nur fünf Teilnehmern erhalten, die wegen Karzinoms oder Morbus Crohn operiert wurden. Im Jahr 2005 untersuchten Guedes et al. die Verteilung von GIP-, GLP-1- bzw. CgA-positiven Zellen mit IHS an Proben aus jeweils 20 cm Dünndarm in 30 menschlichen Leichen .
Es sollte betont werden, dass die vier oben genannten Studien normal erscheinende Gewebeproben ohne Anzeichen pathologischer Veränderungen untersuchten. Das Vorhandensein bösartiger oder entzündlicher Veränderungen im Darmbereich oder der schnelle Beginn des Zellabbaus post mortem könnten jedoch die allgemeine enteroendokrine Zellverteilung und -funktion beeinflusst haben. Darüber hinaus kann die Heterogenität der Teilnehmer die Ergebnisse beeinflusst haben.
In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen beschrieben Sjölund et al, Eissele et al, Adrian et al und Guedes et al eine Variation der L-Zell-Produkte (GLP-1 und / oder PYY) in Abhängigkeit von der Darmlokalisierung mit einer höheren Dichte / Menge im distalen Jejunum und Ileum im Vergleich zum Duodenum und proximalen Jejunum und einer zunehmenden Dichte / Menge vom proximalen zum distalen Dickdarm mit den höchsten Konzentrationen im Rektum . Unsere Ergebnisse unterstützen dieses L-Zellverteilungsmuster bei gesunden Personen und bei Typ-2-Diabetes mit zunehmender GCG- und PYY-Genexpression sowie zunehmender Dichte von GLP-1- und PYY-positiven Zellen entlang des Dünndarms und entlang des Dickdarms Dickdarm. Wir beobachteten auch das größte Signal von L-Zellmarkern (PYY- und GLP-1-positive Zellen und PYY-mRNA-Expression) im Rektum, mit Ausnahme der Expression von GCG. Die Auswirkungen – wenn überhaupt – der beobachteten Unterschiede zwischen den Gruppen (signifikant höhere GCG- und PYY-Expression im Dickdarm von Teilnehmern mit Typ-2-Diabetes im Vergleich zu gesunden Personen) sind derzeit unbekannt. Es ist bekannt, dass der Inkretineffekt bei Typ-2-Diabetes verringert ist, und es wurde vorgeschlagen, dass ein Defekt in der nährstoffinduzierten GLP-1-Sekretion dazu beitragen kann, dieses Phänomen zu erklären. Studien, die GLP-1-Reaktionen auf Nährstoffreize bei Patienten mit Typ-2-Diabetes und Nicht-Diabetikern untersuchen, haben jedoch gezeigt, dass Personen mit Typ-2-Diabetes im Allgemeinen keine reduzierten Plasma-Gesamt-GLP-1-Reaktionen aufweisen .
Wir beobachteten eine Diskrepanz zwischen den GCG-Expressionsniveaus und der Dichte von GLP-1-positiven Zellen entlang des Darms. Dies unterstreicht, dass sich L-Zellen in einem Teil des Dünndarms anders verhalten können als enteroendokrine L-Zellen in einem anderen Teil des Dünndarms, wie von Svendsen et al. vorgeschlagen, die beobachteten, dass sich das Sekretionsmuster von L-Zellen entlang des Gastrointestinaltrakts bei Ratten ändert, d. H. dass L-Zellen unterschiedliche Verhältnisse von PYY und GLP-1 absondern, wobei einige nur GLP-1 absondern . In Übereinstimmung mit diesen Befunden ist es wahrscheinlich, dass distal gelegene L-Zellen Proglucagon in höherem Maße exprimieren als proximal gelegene L-Zellen.
Unsere Befunde einer größeren GIP-Expression und Dichte von GIP-positiven Zellen im proximalen Teil des Dünndarms, die beide distal zur Ileocaecal-Region bei gesunden Personen und solchen mit Typ-2-Diabetes abnehmen, stimmen mit früheren Befunden überein . Im Gegensatz zu Sjölund et al , die fanden, dass GIP-positive Zellen im Dickdarm fehlten, konnten wir im distalen Teil des Darmtrakts geringe Mengen an GIP-positiven Zellen nachweisen. Wir können jedoch nicht ausschließen, dass dies auf eine unspezifische Antikörperbindung zurückzuführen ist. Wir beobachteten jedoch die mRNA-Expression von GIP im Dickdarm beider Gruppen, wenn auch auf sehr niedrigem Niveau. Die Expression von GIP war bei Personen mit Typ-2-Diabetes entlang des gesamten Darmtrakts signifikant größer. Es könnte spekuliert werden, dass die Transkription von GIP als kompensatorische Folge der GIP-Resistenz erhöht ist, d. H. Die reduzierte insulinotrope Wirkung von GIP, die bei Personen mit Typ-2-Diabetes beobachtet wird . In Übereinstimmung damit wurde gezeigt, dass die Nüchtern-GIP-Spiegel bei Teilnehmern mit Typ-2-Diabetes im Vergleich zu nicht-diabetischen Kontrollteilnehmern höher sind , und darüber hinaus wurde vorgeschlagen, dass GIP zur Hyperglykämie beiträgt, die bei Typ-2-Diabetes auftritt (hauptsächlich aufgrund der glukagonotropen Wirkung von GIP) . Die Daten zu den GIP-Reaktionen nach oraler Glukose oder gemischten Mahlzeiten bei Personen mit Typ-2-Diabetes waren jedoch inkonsistent, und eine systematische Überprüfung mit Metaanalyse hat ergeben, dass die postprandialen GIP-Reaktionen bei Personen mit Typ-2-Diabetes und gesunden Personen ähnlich sind .
Da das saure Glykoprotein CgA Bestandteil von Zellvesikeln ist und mehrere Rollen im sekretorischen Prozess endokriner Produkte spielt, wird es als allgemeiner Marker für enteroendokrine Zellen verwendet . Im Gegensatz zu Guedes et al, die eine konstante Dichte von CgA-positiven Zellen entlang des Dünndarms beobachteten, zeigte unsere Studie einen signifikanten Rückgang. Darüber hinaus beobachteten wir eine größere Dichte an CgA-positiven Zellen im Dünndarm gesunder Personen als bei Teilnehmern mit Typ-2-Diabetes. Es könnte spekuliert werden, dass die Gesamtzahl der CgA-positiven Zellen (enteroendokrine Zellen) bei Typ—2-Diabetes verändert ist – entweder als Folge des Typ-2-Diabeteszustands oder vielleicht als Beitrag zur Pathogenese von Typ-2-Diabetes. Wir beobachteten eine ziemlich hohe Anzahl von CgA-positiven Zellen im Rektum beider Gruppen. Kürzlich zeigten Engelstoft et al. bei Mäusen, dass CgA hauptsächlich auf Monoamin-sekretierende enteroendokrine Zellen und spärlicher auf Peptid-sekretierende enteroendokrine Zellen lokalisiert war , was möglicherweise den Vorschlag von Sjölund et al. unterstützt, dass die rektalen enteroendokrinen Zellen eher eine primär lokale (parakrine) als eine systemische Funktion haben könnten .
Da bekannt ist, dass PC1 / 3 Prohormone verarbeitet, die zur Bildung von GIP bzw. GLP-1 führen, erwarteten wir die Anwesenheit von PC1 / 3 entlang des gesamten Darmtrakts. Wir beobachteten jeweils eine Diskrepanz zwischen einer stärkeren Expression von PCSK1 / 3 und einer geringeren Dichte von PC1 / 3-positiven Zellen im Dünndarm von Teilnehmern mit Typ-2-Diabetes im Vergleich zu gesunden Teilnehmern. Wie oben beschrieben, sollte dieser Befund mit der Ansicht interpretiert werden, dass einige enteroendokrine Zellen in einigen Regionen sehr aktiv sein können und in anderen Regionen eine geringe Aktivität aufweisen.
Da PC2 in erster Linie für die Verarbeitung von Proglucagon zu Glucagon in pankreatischen Alpha-Zellen bekannt ist, war es interessant, die mRNA-Expression von PCSK2 und PC2-positiven Zellen entlang des gesamten Darmtrakts zu finden. Dies könnte darauf hindeuten, dass Glucagon im Darm produziert wird, wie kürzlich von Lund et al . In Übereinstimmung damit könnte spekuliert werden, dass die größere PCSK2-Expression im Dünndarm von Personen mit Typ-2-Diabetes zur Bildung von überschüssigem Glucagon führt, was zur Typ-2-diabetischen Hyperglucagonämie beiträgt. Um diesen Aspekt weiter zu klären, sind Studien einschließlich immunhistochemischer Doppelfärbung gerechtfertigt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorliegende Kartierung der Verteilung der enteroendokrinen K- und L-Zellen und der beobachteten Variationen der Expressionsniveaus ihrer verwandten Produkte entlang des menschlichen Darmtrakts in Kombination mit den nachgewiesenen Unterschieden zwischen Teilnehmern mit Typ-2-Diabetes und gesunden Personen ein Nachschlagewerk für Wissenschaftler und Kliniker darstellt. In Kombination mit dem Wissen aus physiologischen Studien über zirkulierende Darmhormone könnten unsere Daten von Wert sein, um zu verstehen, wie der Darm zur Regulierung des Glukosestoffwechsels und des Appetits beiträgt. Die Identifizierung von PC2 in enteroendokrinen Zellen ist interessant, da dies mit der Bildung von Glucagon im menschlichen Darm in Einklang stehen könnte. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um diese Möglichkeit zu belegen und unsere Ergebnisse mit der Pathophysiologie des Typ-2-Diabetes zu verknüpfen.
