Die biokatalytischen Anwendungen für Enzyme sind in den letzten Jahren immens gewachsen, da sie ökologisch korrekt sind, eine hohe Spezifität aufweisen, Chemo-regio-Enantio-Selektivität aufweisen und eine große Vielfalt an Reaktionen aufweisen. Darüber hinaus können die Bedingungen für die Gewinnung und Optimierung der Produktion von Enzymen in Bezug auf Nährstoffe, pH-Wert, Temperatur und Belüftung in Bioreaktoren leicht gesteuert werden. Mikroorganismen können auch genetisch manipuliert werden, um die gewünschten Eigenschaften eines Biokatalysators zu verbessern. Diese Eigenschaften haben die ständig wachsende Suche nach biokatalytischen Prozessen gefördert . Ziel unserer Studie war es, mithilfe eines enzymatischen Prozesses Keratinhydrolysate für Haarpflegeprodukte zu gewinnen. Derzeit werden die handelsüblichen Keratinhydrolysate durch chemische Hydrolyse erhalten. Das vorgeschlagene Verfahren ist umweltfreundlich und erzeugt ein klares Hydrolysat. Im Gegensatz dazu haben die handelsüblichen Hydrolysate aufgrund der Anwesenheit von Säure eine dunkle Farbe. Die klare Farbe ist ein Vorteil bei der Einarbeitung von Keratinhydrolysat in Produkte für Haar- oder Hautkosmetik. Molkenproteine mit einer Molekülmasse von weniger als 10 kDa zeichnen sich durch eine verringerte Allergenität aus. Daher ist es wünschenswert, Fraktionen mit Molekularmassen unter 5 kDa im Hydrolyseprozess zu erhalten. Darüber hinaus zeigten Eremeev et al. die antioxidative Aktivität von Keratinhydrolysaten. Der erste Schritt in dieser Arbeit bestand darin, Federn durch Peptidasen und Keratinasen, die von Bacillus subtilis produziert wurden, in Keratinpeptide und Aminosäuren umzuwandeln. Abbildung 3 zeigt, dass die Federn nach fünf Tagen Wachstum im Medium vom Mikroorganismus abgebaut wurden (90-95%). Die Keratinasen und Peptidasen können auf andere Keratinreste einschließlich Wolle und Hornpulver einwirken. Keratinasen werden in der Futtermittel-, Düngemittel-, Waschmittel-, Leder- und Pharmaindustrie eingesetzt.
A Kontrolle: Bacillus subtilis in federhaltigem Medium (Zeit 0) und B Nach 5 Tagen Wachstum in Federmedium.
Einige Berichte haben die Produktion von Keratinasen durch Bazillus-Arten wie B. subtilis KD-N2 ; B. pumilus KS12 , B. megaterium SN1 . Diese Arbeiten beschreiben jedoch die Isolierung neuer Stämme, die mutierte Produktion und die Charakterisierung von Keratinasen, was auf mögliche Anwendungen hindeutet. In unserer Studie lag der Fokus auf dem von B. subtilis produzierten Federkeratinhydrolysat, speziell den Peptiden, und das Ziel unserer Arbeit war es, die Wirkung des Hydrolysats auf die Haarfaser zu analysieren. Andere Autoren haben unterschiedliche Methoden für die Keratinasenanalyse verwendet, und diese große Variabilität macht es schwierig, die Ergebnisse zu vergleichen. Der im vorliegenden Manuskript verwendete native Stamm von Bacillus subtilis zeigte jedoch eine ausgezeichnete proteolytische (Gelatinase) Aktivität mit einer Produktion von 350 U/ml bzw. 400 U/ml Keratinasen und Proteasen.
Die durch enzymatischen Abbau gebildeten Keratinpeptide wurden mittels Matrix-unterstützter Laserdesorption/Ionisationszeit (MALDI-TOF) Massenspektrometrie analysiert. Zunächst können wir durch den Vergleich der beiden Spektren die unterschiedlichen Profile der beiden Hydrolysate beobachten. Die den Peptiden entsprechenden multiplen Peaks mit einem niedermolekularen Gewicht überwiegend im Bereich von 800 bis 1079 m/z wurden von Bacillus subtilis erzeugt (Abbildung 4A). Wir können auch einige Ionen mit m / z im Bereich von 1171,57 bis 1758,96 beobachten. Während für die kommerzielle Keratinhydrolysatzubereitung KH1 die Peaks im Bereich von 900 bis 1400 m / z konzentriert waren, wie in Abbildung 4 (B) gezeigt. In derselben Abbildung sind auch mehrere Peaks zwischen 1400 und 2100 zu sehen. So enthält das von B. subtilis hergestellte Hydrolysat Peptide mit niedrigeren Molekularmassen. Diese niedermolekularen Peptide können effizienter in die Haarfaser eindringen und diese Eigenschaft ist ein positiver Unterschied zu den kommerziellen Hydrolysaten. Eine frühere Arbeit unserer Gruppe, die menschliches Haar als Substrat verwendete, zeigte mehrere Peaks von 816 bis 2080 m⁄ z nach 4 Tagen Kultur . Die Molekularmassenanalyse des von der B.der Subtilis-Stamm SLC, der Federn als Substrat verwendete, zeigte, dass die meisten Peptide, die aus Hühnerfedern gewonnen wurden, eine Molekülmasse im Bereich von 500-3000 Dalton aufwiesen . In einem thermophilen Meiothermus ruber H328 wurden bei der MALDI-TOF-Analyse von solubilisierten Produkten nach Wachstum auf Federmedium nur Oligopeptide mit weniger als 1.000 Dalton nachgewiesen. Diese Ergebnisse bestätigen, dass mikrobielle Enzyme Peptide mit einer niedrigeren Molekülmasse produzieren.
MALDI-TOF MS-Analyse der enzymatischen Keratinhydrolysate aus Federkeratin durch Bacillus subitilis (A) und ein handelsübliches Hydrolysat (KH1) (B). Für Details siehe Materialien und Methoden.
Eine vorläufige Analyse der enzymatischen Keratinhydrolysate wurde mittels Dünnschichtchromatographie (HPTLC) durchgeführt und Peptide und Aminosäuren mit einer niedrigeren molekularen Masse wurden beobachtet, wie in Abbildung 5, Spur 2, im Vergleich zu dem kommerziellen Hydrolysat (KH1) in Spur 3 gezeigt. Als Standard wurde die Aminosäure Glycin in Spur 1 verwendet.
HPTLC-Analyse von Keratinpeptiden nach Filtration durch Ultrafiltration im Amicon-System (Millipore, 1000 Dalton). 1 – Aminosäure Glycin. 2 – Feather Keratin Peptide durch enzymatische Hydrolyse erhalten. 3 – Handelsübliches Hydrolysat (KH1).
Nach der Fermentation hatte das enzymatische Hydrolysat eine Proteinkonzentration von 3,5 mg/ml. Nach der Filtration ging der Proteingehalt auf1,5 mg / ml, entsprechend einem Prozentsatz von 42, 8% bezogen auf das Gesamtprotein. Das enzymatische Hydrolysat wurde in einer Konzentration von 10% auf die Haarsträhnen aufgetragen, wie in Materialien und Verfahren und in Abbildung 2 beschrieben.
Das Hydrolysat wurde mit einem milden Shampoo und einem nach Tabelle 1 und 2 hergestellten Rinse-Conditioner appliziert. Tabelle 3 zeigt, dass bei allen mit den enzymatischen Hydrolysaten und mit Glätteisen bei 180°C behandelten Haaren eine Erhöhung der Hydratation auftritt. Ohne die Anwendung von Wärme war der Prozess nicht effizient, was darauf hindeutet, dass das Erhitzen wichtig ist, um die Hydrolysate in das Haar einzubauen.
Proteinhydrolysate, insbesondere solche mit einer niedermolekularen Gewichtsverteilung – d.h. < 1.000 Dalton sind dafür bekannt, das Haar effizient zu schützen und zu pflegen. Zur Herstellung von Hydrolysaten wurden verschiedene Proteinquellen verwendet. Weizenprotein , Wollkeratin und kollagene Hydrolysate sind Beispiele, die in Haut- und Haarpflegeprodukten verwendet wurden und bekanntermaßen eine verbesserte Verträglichkeit, ein besseres Gefühl, eine bessere Befeuchtung und die Erhaltung der natürlichen Struktur ermöglichen . In Haarpflegeprodukten haben die Peptide mit niedrigerem Molekulargewicht zwei Wirkungen: 1) Sie können in die Kortikalis der Haarfaser eindringen und 2) Sie können eine Oberflächenbeschichtung fördern. Die Penetration scheint bei längeren Behandlungen tiefer zu sein. Darüber hinaus zeigt gebleichtes Haar im Vergleich zu nicht geschädigtem Kontrollhaar eine höhere Penetration von Hydrolysaten . Diese Eigenschaften haben positive Auswirkungen auf die Haarstruktur, ersetzen verlorenes Keratin und haben auch eine Anti-Aging-Wirkung . Die Wirkung des Keratinpeptids auf die Haut in einer wässrigen oder in Liposomenformulierung wurde durch untersucht und eine Erhöhung der Hydratation und Elastizität als Ergebnis der Keratinpeptidanwendung wurde beobachtet.
Die Wirkung der Anwendung des enzymatischen Hydrolysats auf die Haarfaser wurde mittels REM bewertet (Abbildungen 6, 7 und 8). Alle Abbildungen zeigen mikroskopische Aufnahmen von mit dem enzymatischen Hydrolysat behandelten und unbehandelten Haarfasern. Eine Zunahme der Helligkeit und Weichheit wurde durch sensorische Analyse beobachtet (Daten nicht gezeigt). In den mikroskopischen Aufnahmen wurden jedoch Ablagerungen von Federkeratinhydrolysaten in der Verbindung der Nagelhaut aller Haartypen beobachtet. Diese Ablagerung trägt wahrscheinlich zur Versiegelung der Nagelhaut bei. Auch Wärme ist für die vollständige Versiegelung der Nagelhaut unerlässlich. Farbige Faser wurde durch die Hydrolysate profitiert, wenn sie mit Hitze aufgetragen (Abbildung 6C, D). Hydrolysate hafteten mehr an den zuvor gefärbten und geglätteten Haarfasern an (Abbildung 7C, D), was darauf hinweist, dass die Kombination von Färbung und Glättung die Wirkung der Keratinpeptide begünstigt. Abbildung 8 (A, B) zeigt, dass die Bleichbehandlung eine akzentuierte Schädigung der Haarfaser förderte. Das Auftreten der Vorderkante der Nagelhautschuppen weist auf ein Aufbrechen der Schuppen hin (B). Die Applikation der enzymatischen Hydrolysate mit Wärme führte zur Versiegelung der Kutikula, deren Ränder jedoch gebrochen blieben (C, D).
Rasterelektronenmikroskopie (REM) Analyse von gefärbten Haaren A, B -Kontrolle; C, D – Nach der Behandlung mit den enzymatischen Hydrolysaten und Glätteisen bei 180 °; E, F- Nach der Behandlung mit den enzymatischen Hydrolysaten ohne Wärme. Pfeile zeigen die enzymatischen Hydrolysatablagerungen an.
REM-Mikrographieanalyse von gefärbtem und geglättetem Haar nach enzymatischer Hydrolysatbehandlung. Behandeltes Haar A, B – Kontrolle; C, D- Nach der Behandlung mit den enzymatischen Hydrolysaten und Glätteisen bei 180 °; E, F- Nach der Behandlung mit den enzymatischen Hydrolysaten ohne Hitze die Ablagerung der enzymatischen Hydrolysate auf der Waage beachten (Pfeil).
Elektronische rastermikroskopische Aufnahmen, die von einem unbehandelten gebleichten Haar (A, B) erhalten und mit den enzymatischen Hydrolysaten mit Wärme (C, D) oder ohne Wärme (E, F) behandelt wurden. Schwarzer Pfeil zeigt Ablagerung von Peptiden aus den enzymatischen Hydrolysaten und weißer Pfeil zeigt die gebrochenen Kanten der Kutikula.
Wenn die Haarchemie modifiziert wird, werden einige der natürlichen Eigenschaften des Haares beeinträchtigt. Mehrere Mechanismen können die Haarfaser schädigen. Zum Beispiel, Umweltbelastungen und UV-Strahlung photooxidiert Proteine. Die Photooxidation von Proteinen führt zur Spaltung von Disulfidbindungen, die die Proteine vernetzen, und zum Brechen von Thioesterbindungen, was zur Freisetzung gebundener Oberflächenlipide und zum Verlust der Haarstruktur führt. Diese Reaktionen führen zu einer Verschlechterung der Haareigenschaften, die sich für die Verbraucher in Form von schlechter Handhabbarkeit, Trockenheit und Sprödigkeit, Glanzverlust und im Extremfall verminderter Festigkeit bemerkbar machen . Es ist bekannt, dass einige kosmetische Behandlungen wie permanentes Curling, permanentes Färben, Bleichen und Entspannen / Glätten die Haareigenschaften verändern . Selbst kosmetische Behandlungen wie tägliches Kämmen und Bürsten können das Haar schädigen . Kürzlich verwendeten Cao et al. unterschiedliche Konzentrationen der Fermentationsbrühe (Hühnerfedern), die aus Stenotrophomonas maltophilia gewonnen wurde, im Haar. Der Überstand wurde 30 min inkubiert. Die Brühe erwies sich als schützend für das Haar, wie die verbesserte Flexibilität und Festigkeit sowohl für normales als auch für geschädigtes Haar zeigt.
Sionkowska, et al. untersuchten mittels UV–Vis-Spektroskopie, Fourier-Transformation, Infrarotspektroskopie (FTIR) und Fluoreszenzspektroskopie den Einfluss der UV-Bestrahlung auf Keratinhydrolysate. Während der UV-Bestrahlung von Keratinhydrolysaten wurden neue Photoprodukte gebildet, und es wurde auch ein leichter Anstieg der oxidierten Schwefelspezies beobachtet. Die Autoren schlugen vor, dass die Photodegradation von Keratinhydrolysaten eine nützliche Methode zur Herstellung von Hydrolysaten mit niedrigerem Molekulargewicht sein könnte. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Zunahme der Hydratation, Helligkeit und Weichheit in den verschiedenen Haartypen nach der Behandlung mit 10% Keratinpeptiden beobachtet, die durch den enzymatischen Hydrolyseprozess erhalten wurden. Die Verwendung von Federn, einem Industrieabfall, der von Geflügel als Biomassequelle für den Prozess erzeugt wird, ist sehr interessant, da dieser Rohstoff billig ist und nicht in ein neues Produkt mit einem Gesamtwert umgewandelt wird. Derzeit werden Keratinhydrolysate üblicherweise aus keratinhaltigen Tierteilen wie Federn, Hörnern, Hufen, Haaren und Wolle hergestellt. Aromatische Aminosäuren (Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin) und Cystin (schwefelhaltige Aminosäuren) spielen eine zentrale Rolle in der Photochemie von Keratin . Einige Industrien haben Produkte entwickelt, die einen Komplex von 18 freien Aminosäuren verwenden, die aus Weizen-, Mais- und Sojaproteinen gewonnen werden, um die natürliche Zusammensetzung von Keratin nachzuahmen. Der hohe Schwefelaminosäuregehalt des Sojas ähnelt dem von menschlichem Haar und Wolle . Keratin ist jedoch ein unersetzliches Protein in Bezug auf seine mechanischen und schützenden Eigenschaften.
Das in der vorliegenden Arbeit beschriebene enzymatische Verfahren kann für industrielle Abfälle/Reststoffe im Allgemeinen zur Herstellung von Mehrwertprodukten verwendet werden. Frühere Studien in der Literatur haben die Verwendung von Keratinasen / Peptidasen zum Recycling von Federkeratin beschrieben, das von der Geflügelindustrie weggeworfen wird . Die vorliegende Arbeit berichtet erstmals über die Verwendung von Keratinpeptiden in der Kosmetikindustrie, insbesondere im Haarpflegesegment. Unter Berücksichtigung all dieser Faktoren ist die enzymatische Methode zur Herstellung von Keratinpeptiden für Haarpflegeprodukte eine attraktive und umweltfreundliche Methode mit großem Potenzial in der Kosmetikindustrie.
