Gesamt-RNA wurde mit Tripure-Isolationsreagenz (Roche) extrahiert.
RNA-Proben wurden mit rnasefreiem DNaseI behandelt und mit dem RNeasy Mini Kit (QIAGEN) gereinigt. Die resultierende RNA wurde mittels Ribo-Zero rRNA Removal Kit (Human/Maus/Ratte) (Epizentrum) von ribosomaler RNA abgereichert. Die rRNA-abgereicherte RNA wurde verwendet, um die Erststrang-cDNA unter Verwendung des SuperScript® III-Erststrangsynthesesystems (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers zu synthetisieren. Anschließend wurde der zweite Strang unter Verwendung von E. coli DNA Ligase (Invitrogen), E. coli-DNA-Polymerase (Invitrogen) und dUTP-, dCTP-, dATP- und dGTP-Set (je 10 µmol, Promega) im zweiten Strangpuffer (Invitrogen). Anschließend wurde die cDNA mit Covaris auf ca.300bp geschert. Nach der Fragmentierung wurden die Proben mit MinElute-Säulen (Qiagen) gereinigt. Und die hervorstehenden 3′- und 5′-Enden der Fragmente wurden mit T4-DNA-Polymerase (NEB) und T4-DNA-Polynukleotidkinase (NEB) in T4-DNA-Ligase-Puffer (NEB) repariert. Als nächstes wurden dA-Enden durch Verwendung des Klenow-Fragments (3′-> 5′ exo-, NEB) in Puffer 2 (NEB) erzeugt. Adapterligationsreaktionen wurden dann unter Verwendung von indizierten Adaptern und Quick Ligase (NEB) aufgebaut. Die Produkte wurden als Vorlage für die UNG (Fermentas) -Behandlung und PCR-Amplifikation unter Verwendung von Phusion High-Fidelity-DNA-Polymerase (NEB) verwendet. Die Bibliotheken wurden auf 2% E-Gel® Allzweck-Agarosegelen (Invitrogen) visualisiert. Die barcodierten Bibliotheken wurden auf einer einzigen Spur eines HiSeq2500 (Illumina) sequenziert.
