Einleitung
In der Biotechnologie werden sowohl Mikroorganismen als auch höhere Zellen und deren Wirkstoffe mit dem Ziel eingesetzt, wünschenswerte Umwandlungen verschiedener Substrate zu erreichen (Tripathi et al., 1997). L-Phenylacetylcarbinol ist das Ausgangsmaterial für die chemische Synthese von L-Ephedrin-Hydrochlorid und Pseudo-Ephedrin-Pharmazeutika, die als abschwellende, antiasthmatische (Shin und Rogers, 1995) und kürzlich berichtete, in der Adipositas-Kontrolle (Astrup et al., 1992). Aromatisches Substrat Benzaldehyd ergibt L-PAC durch Biotransformationsmethode. Bestimmte Hefestämme besitzen Pyruvatdekaroxylase (PDC) und Phenoldehydrogenase (ADH) Enzyme, die L-PAC und Benzylalkohol, ein Nebenprodukt, jeweils aus Benzaldehyd produzieren (Nikolova und Ward, 1991). Biotransformationspotentiale der wachsenden Zellen frei geerntete Zellen immobilisierte Zellen und isoliertes rohes sowie gereinigtes Enzym wurden ausführlich untersucht (Liew et al., 1995; Shin und Rogers, 1996a, b).
Die Rolle neuartiger Stämme bei der Biokonversion ist ein wichtiger Aspekt. Die Produktion von L-PAC wurde durch freie und immobilisierte Zellen von Saccharomyces cerevisiae unter verschiedenen Wachstums- und Biotransformationsbedingungen untersucht. Wir haben jedoch die L-PAC-Produktion aus Benzaldehyd unter Verwendung verschiedener neuartiger Stämme unter verschiedenen Wachstums- und Biotransformationsmodalitäten untersucht, um die idealen Bedingungen zu überwachen, die eine maximale Produktausbeute bei konstanter Substratkonzentration und Zelldichte ermöglichen. Die L-PAC-Produktion ist in Schema 1 angegeben.
| Schema 1: | |
Materialien und Methoden
Herstellung von L-Phenylacetylcarbinol mit normalen Zellen von Sccharomuces Cerevisiae (BY)
Die Herstellung von L-Pac (einem wichtigen Zwischenprodukt für viele Arzneimittel) aus Benzaldehyd durch Hefen ist der potenzielle Weg in der Fermentationsindustrie zur Herstellung von Ephedrin und anderen Arzneimitteln. Die vorliegende Studie wurde vom Autor am Sultan-Ul -Uloom College of Pharmacy in Hyderabad, Indien, im Jahr 2004 durchgeführt.Die Stammkultur der Bäckerhefe wurde frisch subkultiviert (Ellaiah and Krishna, 1987) auf frischen sterilen YEMA Medium Slants und 36 h bei Raumtemperatur (ca.28°C) inkubiert. Somit wurde die 36 h Kultur zur Ernte verwendet. Die Kultur der Bäckerhefe wurde durch Schütteln in 5 ml sterilem Wasser geerntet. Die geerntete mikrobielle Suspension wurde in Inokulummedium-I überführt.Die Zusammensetzung des Inokulummediums ist wie folgt:
Der Kolben wurde 24 h bei 28°C auf einem Rotationsschüttler (180 UPM) inkubiert.
Die mikrobielle Zählung wurde unter Verwendung der Neubauer-Zählkammer durchgeführt. Die mikrobielle Suspension wurde so verdünnt, dass jeder ml Suspension 200×106 Zellen enthielt. Zehn Milliliter Inokulum aus IM-I wurden in 100 ml Inokulationsmedium-II überführt, dessen Zusammensetzung unten angegeben ist:
Die Kolben wurden auf einem Rotationsschüttler (180 U/min) für 16 h inkubiert.
Einhundert Milliliter Produktionsmedium wurden hergestellt. In den meisten Studien wurde Melassemedium als Produktionsmedium verwendet, und für die Vergleichsstudie wurde Zuckerrohrsaftmedium mit Harnstoff als Produktionsmedium verwendet. Zehn Milliliter Inokulum aus IM-II wurden auf Produktionsmedien, deren Zusammensetzung der von IM-II entspricht, überführt und 9 h am Rotationsschüttler inkubiert. Bei 9 h wurde Nährstoff (20 ml 50% ige Melasse) zum Melasse-Produktionsmedium und Nährstoff (20 ml 50% iger Zuckerrohrsaft) zum Zuckerrohr-Produktionsmedium gegeben und auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Ab 10 Uhr 0.Zum Produktionsmedium wurden 6% destillierter Benzaldehyd in 6 Teildosen im Abstand von einer halben Stunde zugegeben.
Anschließend wurden Kolben auf dem Rotationsschüttler für 24 h inkubiert. die Kolben enthaltend 130 ml Brühe (d.h. 100 ml Produktionsmedium+10 ml Inokulum+20 ml Nährmedium) wurden mit 130 ml Benzol (Lösungsmittel) versetzt und l5 min in Scheidetrichtern geschüttelt. Dann wurde die organische Schicht abgetrennt und durch saugfähige Baumwolle filtriert. Schließlich wurde das Lösungsmittel Benzol abdestilliert, um L-PAC-Produkt zu erhalten.
Herstellung von L-Phenylacetylcarbinol mit neuen Isolaten von Hefen:
Verfahren zur Biokonversion:
In Vergleichsstudien wurden die neuen Kulturen verwendet, um ihr Biotransformationspotential mit Bäckerhefe abzuschätzen und zu vergleichen. Die Stammkulturen von Candida pseudointermedia MTCC Nr. 6225, Candida pseudountermedia MTCC Nr. 6352 und Issatchenkia orientalis MTCC Nr. 6351 wurden aseptisch auf strilen YEMA-Schrägen mit sterilisierter Transferschleife im Sterilbereich subkultiviert (laminarer Luftstrom).
Das zuvor erwähnte Verfahren (Ellaiah and Krishna, 1987) wurde auch für die neuen Stämme wiederholt. In den meisten Studien wurde Melassemedium als Produktionsmedium und für Vergleichsstudien Zuckerrohrsaftmedium mit Harnstoff (Kaur und Kocher, 2002) als Produktionsmedium verwendet.
Ergebnisse und Diskussion
L-Phenylacetylcarbinol ist eine gelb gefärbte Flüssigkeit. Sein angegebenes spezifisches Gewicht beträgt 0,93 bei Raumtemperatur. L-PAC, das von Isolaten einschließlich Bäckerhefen (S.cerevisia) hergestellt wurde, zeigte den gleichen spezifischen Gewichtswert. Der pH-Wert von L-PAC (1: 1-Verhältnis von L-PAC-Probe und Wasser) wird mit 3,84 angegeben. In diesen Experimenten zeigte das durch Biotransformation von vier verschiedenen Hefen wie Bäckerhefe, Candida pseudointermedia (6225), Candida pseudointermedia (6352) und Issatchenkia orientals (6351) erhaltene L-PAC-Produkt die gleichen pH-Werte. Rf-Wert von L-PAC wurde berichtet (Groger und Erge, 1965) in Chloroform als mobile Phase auf Kieselgel Joddämpfe wurden zum Nachweis von Flecken verwendet.
In Entwicklungschromatogrammen wurde Chloroform als Frontlösungsmittel mit Lösungsmittelgemisch (30% Ethylacetat 70% Hexan) als Laufmittel verglichen. Die spätere Lösungsmittelfront zeigte eine bessere Trennung als Chloroform. So verwendeten wir 30% Ethylacetat und 70% Hexan als Lösungsmittelfront in allen unseren Experimenten.
L-PAC reagiert auch in UV-Licht, Joddämpfen und β-Methoxynaphthalin-Verkohlung. Der HF-Wert von Standard-L-PAC liegt bei etwa 0,33. Das L-PAC-Produkt verschiedener Isolate zeigte den gleichen Hf-Wert.
Das in L-PAC enthaltene Methylketon unterliegt der Idoformreaktion (Smith und Hendlin, 1954). Es wird zunächst halogeniert und in Gegenwart von Alkali wie NaOH zu Idoform gespalten. Diese Reaktion ist sehr spezifisch für L-PAC und tritt bei Nebenprodukten nicht auf. Durch verschiedene Isolate hergestelltes L-PAC führte zu Idoform.
Durch polarimetrische und kolorimetrische Schätzungen wurde die prozentuale Biokonversion in verschiedenen Hefeisolaten geschätzt. Andere Fermentationsprodukte (z.B. Benzylalkohol, Benzoesäure sowie nicht umgesetzter Benzaldehyd) wurden mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Gaschromatographie (GC) untersucht. Die chemische Struktur von L-PAC wurde identifiziert und an 1H-NMR- und UV-Spektraldaten angepasst.
Mehrere Arbeiter (Ellaiah und Krishna, 1987) führten eine Fermentation in Melasse als Produktionsmedium durch, zusätzlich zu dem in der Industrie verwendeten Melassemedium für die Biokonversionsreaktion in der L-PAC-Produktion.
In der vorliegenden Untersuchung haben wir den Zuckerrohrsaft als Produktionsmedium in der L-PAC-Produktion ausprobiert. Als Produktionsmedium wurde Zuckerrohrsaft mit 0,25% Harnstoff verwendet, der mehr Produkt von L-PAC lieferte als Melasse. Darüber hinaus war die Produktextraktion aus Zuckerrohrsaftmedium sehr bequem als aus dem Melassemedium. Der mit verschiedenen Hefeisolaten erhaltene Biokonversionsgrad in % ist in Tabelle 1 angegeben.
Das Biotransformationspotential freier Zellen der Bäckerhefe (S.cerevisiae) wurde sowohl in Melasse als auch in Zuckerrohrsaft als Produktionsmedium untersucht. Im Melassemedium wurde eine 25% ige Biokonversion beobachtet, während im Zuckerrohrsaftmedium eine 28% ige Biokonversion beobachtet wurde.
| Tabelle 1: | Umwandlung von Melasse und Zuckerrohrsaft als Produktionsmedium zur Herstellung von L-PAC |
Das Biotransformationspotential freier Zellen von Candida pseudointermedia MTCC No. 6225 wurde sowohl in Melasse als auch in Zuckerrohrsaft als Produktionsmedium untersucht. In Melasse wurde eine Biokonversion von 23,43% beobachtet, während in Zuckerrohrsaftmedium eine Biokonversion von 23,75% beobachtet wurde.
Biotransformationspotential freier Zellen von Candida pseudointermedia MTCC-Nr. 6352 wurde sowohl in Melasse als auch in Zuckerrohrsaft als Produktionsmedium untersucht. In Melasse wurde eine Biokonversion von 33,47% beobachtet, während in Zuckerrohrsaftmedium eine Biokonversion von 48,76% beobachtet wurde.
Das Biotransformationspotential freier Zellen von Issatchenkia orientalis MTCC No. 6351 wurde sowohl in Melasse als auch in Zuckerrohrsaft als Produktionsmedium untersucht. In Melasse wurde eine Biokonversion von 37,16% beobachtet, während in Zuckerrohrsaftmedium eine Biokonversion von 60,61% beobachtet wurde.
Fazit
Abschließend wurde das vorliegende Verfahren zur Verwendung neuer Hefestämme aus natürlichen Quellen für Biotransformationsstudien untersucht und für die Biokonversion von Benzaldehyd zu L-PAC verwendet. Drei Stämme wurden aus verschiedenen natürlichen Quellen wie Blackgrapes isoliert, Dattelfrucht und Zuckerrohrsaft und wurden am Institut für mikrobielle Technologie identifiziert, Chandigarh. Diese drei Stämme wurden als Candida pseudointermedia MTCC No. 6225 (BGY), Issatchenkia orientals MTCC No. 6351 (DY), Candida pseudointermedia MTCC No. 6352 (SCY) bezeichnet.Was eine wichtige Ergänzung zu den derzeit bestehenden Verfahren sein wird. Die wichtigsten Ergebnisse der vorliegenden Forschung sind die Verwendung von 3 neuen Hefestämmen zur Herstellung von L-PAC und die Verwendung von Zuckerrohrsaft als Produktionsmedium für die Herstellung von L-PAC. Wir sind in beiden Versuchen erfolgreich und es gibt eine erhebliche Steigerung der prozentualen Ausbeute an L-L-PAC, wenn Zuckerrohrsaft als Produktionsmedium verwendet wurde. Obwohl Zuckerrohrsaft im Vergleich zu Melasse teuer ist, erwies sich das Extraktionsverfahren mit Zuckerrohrsaft im Vergleich zu Melasse als viel einfacher. Weitere Forschungsmodalitäten wie verschiedene Faktoren, Immobilisierungsstudien, Mutationsstudien usw., konnte helfen, wenn es die kosteneffektiven Methoden für die Produktion von L-PAC herstellte, indem es Zuckerrohrsaft als Produktionsmedium verwendete. Dies ist der erste Bericht über die Verwendung von Candida pseudointermedia und Issatchenkia orientalis für Biokonversionsstudien von Benzaldehyd zu L-PAC. Die Verwendung von Zuckerrohrsaft als Produktionsmedium in Biotransformationsstudien von Benzaldehyd zu L-PAC ist auch der erste Bericht dieser Art. Darüber hinaus zeigte Zuckerrohrsaft ein erhöhtes Biokonversionspotenzial als Melassemedium. Die neuartigen Stämme können wir für die verschiedenen chemischen Reaktionen erforschen. Weitere Studien in dieser Richtung sind im Gange.
Danksagung
Die Autoren danken IMTECH, Chandigarh, für die Identifizierung der neuartigen Stämme und die Zuweisung der MTCC-Nummern.
