High Fidelity & Effiziente PCR Enzym: KOD DNA polymerase
Die hyperthermophile archaea Thermococcus kodakaraensis KOD1 (früher Pyrococcus kodakaraensis KOD1) (Abb. 1) wurde aus einer solfatarischen heißen Quelle isoliert (Abb. 2) auf der Insel Kodakara (Abb. 3) in Japan und wurde identifiziert und charakterisiert.
In diesem KOD1-Stamm wurde eine Familie-B-DNA-Polymerase (KOD-DNA-Polymerase) gefunden, die verschiedene einzigartige Eigenschaften aufweist (1).
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Abb. 1. Thermococcus kodakaraensis KOD1
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Abb. 2. Solfatara (Kodakara island, Japan)
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Abb. 3. Insel Kodakara (Präfektur Kagoshima, Japan)
Die KOD-DNA-Polymerase zeigt eine starke 3’→ 5′-Exonukleaseaktivität (Korrekturleseaktivität), eine Aktivität, die der Taq-DNA-Polymerase fehlt.
Darüber hinaus zeigt dieses Enzym eine ausgezeichnete Prozessivität und Dehnungsfähigkeit und zeigt eine fünffach höhere Dehnungsrate (100-130 Nukleotide / Sekunde) und eine 10-15-fach höhere Prozessivität (> 300 Basen) als die von Pyrococcus furiosus (Pfu-DNA-Polymerase). Die Dehnungsrate dieses Enzyms ist etwa 2-mal höher als die der Taq-DNA-Polymerase (Tabelle 1) (Fig. 4) (1).
Tabelle 1. Eigenschaften von thermostabilen DNA-Polymerasen
| Proterty | Wert für angegebene DNA-Polymerase | ||
|---|---|---|---|
| KOD-DNA-Polymerase | Pfu-DNA-Polymerase | Taq-DNA-Polymerase | |
| Herkunft | Archaea | Archaea | Bakterien |
| Abgeleitete Molekülmasse (kDa) | 90.0 | 90.1 | 93.9 |
| Optimale Temperatur (ºC) | 75 | 75 | 75 |
| Optimaler pH-Wert bei 75ºC | 6.5 | 6.5 | 8.0-8.5 |
| Thermostabilität (Halbwertszeit) | 95ºC,12 h; 100oC, 3,0 h | 95ºC, 6 h; 100ºC, 2,9 h | 95ºC, 1.6h |
| 5’→3′ exonuclease activity | – | – | – |
| 3’→5′ exonuclease activity | + | + | – |
| Terminal transferase activity | – | – | – |
| Processivity (bases) | >300 | <20 | ND |
| Elongation rate (bases/s) | 106-138 | 25 | 61 |
Fig. 4. Vergleich der Dehnungsraten von KOD Pfu und Taq DNA-Polymerase.
Die Dehnungsrate wurde entsprechend der Länge der synthetisierten DNA unter Verwendung von M13 ssDNA als Template bei 75ºC gemessen.
Parallel zur Untersuchung der Aktivitäten der KOD-DNA-Polymerase wurden Neutralisationsantikörper für die Polymerase und Korrekturleseaktivitäten entwickelt (2). Diese Antikörper können unter Verwendung der KOD-DNA-Polymerase auf die „Hot-Start-PCR-Technologie“ aufgebracht werden.
Die 3D-Struktur der DNA-Polymerase wurde 2003 charakterisiert (Abb. 5) (3).
Abb. 5. 3-D-Struktur der KOD-DNA-Polymerase
J. Mol. Biol., 306: 469-477 (2001)
KOD -Plus- (Artikelnummer. KOD-201) wurde auf Basis von KOD-DNA-Polymerase entwickelt und weist eine hohe PCR-Treue auf (Tabelle 2).
Tabelle 2. Vergleich der Mutationshäufigkeit jedes PCR-Enzyms.
| Gesamtzahl der sequenzierten Basen | Anzahl der mutierten Basen | Mutationshäufigkeit (x10-5) | |
|---|---|---|---|
| KOD -Plus- | 145,753 | 5 | 3.4 |
| KOD FX | 144,535 | 19 | 13.1 |
| Pfu-DNA-Polymerase | 113,080 | 12 | 10.6 |
| Taq-Base Lang-PCR Enzym | 167,343 | 218 | 130.3 |
| Taq DNA-Polymerase | 102,708 | 145 | 141.2 |
Die Treue wurde als Mutationshäufigkeit durch Sequenzierung des PCR-Produkts gemessen. Nach Klonierung des PCR-Produktes (2,4 kb der humanen Beta-Globin-Region) wurden ca.96 Klone selektiert und sequenziert.
KOD FX (Artikelnummer. KFX-101) wurde auf Basis von KOD-DNA-Polymerase entwickelt und zeigt eine deutlich höhere PCR-Erfolgsrate (bezogen auf Effizienz und Dehnungsfähigkeit) als KOD -Plus- (Code-Nr. KOD-201) oder andere Taq-basierte PCR-Enzyme. KOD FX ist auch wirksam für die Amplifikation von rohen Proben (z. B. Mausschwanzlysat, kultivierte Zellen).
Abb. 6. Direkte Amplifikation aus einem rohen Mausschwanzlysat
1,2: KOD FX
3~6: Enzyme anderer Unternehmen
M: Marker
