C. Polyacrylamid eingebettet mit fluoreszierenden Kügelchen
Wie im vorhergehenden Abschnitt beschrieben, haben sich Siliziumsubstrate bei der Messung der von sich schnell bewegenden Keratozyten ausgeübten Kräfte als wertvoll erwiesen. Dieselben Substrate sind jedoch für die Untersuchung der meisten Säugetierzellen viel weniger nützlich. Damit die Traktionen genau berechnet werden können, muss das Substrat auf die Motilität und Krafterzeugung eines bestimmten Zelltyps abgestimmt sein. Es ist schwierig, ein Siliziumsubstrat mit der gewünschten Nachgiebigkeit für sich langsamer bewegende Zellen, die höhere Kräfte ausüben können, genau herzustellen. Um diese Einschränkung zu überwinden, verwendeten Dembo und Wang (1999) ein Substrat aus Polyacrylamid, das mit submikrometergroßen Fluoreszenzperlen eingebettet war. Die Konformität von Polyacrylamid-Substraten kann chemisch durch Variation der Monomer- und Vernetzerkonzentrationen eingestellt werden (Pelham und Wang, 1997). Polyacrylamid bietet gegenüber Siliziumsubstraten mehrere zusätzliche Vorteile. Über einen weiten Verformungsbereich zeigt es ein linear elastisches Verhalten. Auch ist Polyacrylamid typischerweise nicht für die Zellbindung allein zugänglich, ohne die Konjugation spezifischer Zelladhäsionsliganden (Nelson et al., 2003). Daher ist es ein perfektes Gerüst, um die Zelladhäsion und das Verhalten auf kontrollierbare, definierte Weise zu untersuchen.
Die Rechenmethode, mit der Verformungen im Substrat zur Bestimmung der von der Zelle ausgeübten Traktionen verwendet werden, ist den Methoden, die auf den oben genannten beanspruchten Siliziumsubstraten angewendet werden, sehr ähnlich. Die Verwendung von Fluoreszenzmarkern hat jedoch die Tracking-Methode und die Fähigkeit, ein genaues Dehnungsfeld zu berechnen, erheblich verbessert.
Dembo und Wang veröffentlichten mehrere Studien mit der resultierenden Technik, der Traktionskraftmikroskopie, die die Mechanismen der Fibroblastenmigration aufklären. Insbesondere haben sie gezeigt, dass die Lamellipodien der Zelle fast die gesamte für die Vorwärtsbewegung erforderliche Kraft bereitstellen (Munevar et al., 2001a). Ihre Ergebnisse zeigen, dass das Lamellipodium eine mechanische Einheit ist, die sich vom Rest des Zellkörpers unterscheidet. Interessanterweise scheint dieselbe mechanische Teilung innerhalb der Zelle in H-ras-transformierten Zellen nicht zu existieren, was vielleicht den Unterschied in ihrem beweglichen Verhalten erklärt. Darüber hinaus Beningo et al. (2001) untersuchten die Rolle fokaler Adhäsionen bei der Regulierung der Traktionserzeugung und stellten fest, dass die Größe fokaler Adhäsionen umgekehrt mit der erzeugten Kraft zusammenhängt. Darüber hinaus entspricht die Verteilung der Adhäsionen nicht gut der Verteilung der Zugkräfte. Die Autoren schlussfolgern, dass diese Ergebnisse darauf hindeuten könnten, dass frühe fokale Komplexe für starke Antriebskräfte verantwortlich sind, und die Reifung dieser Adhäsionsstellen führt zu einer Veränderung in passive Verankerungsstellen — eine Schlussfolgerung, die in der Literatur ausführlich diskutiert wurde. Zusätzlich untersuchten Dembo und Mitarbeiter die dynamischen Rollen von Front-versus-Rear-Adhäsionen (Munevar et al., 2001b), Myosin IIb (Lo et al., 2004), fokale Adhäsionskinase (Wang et al., 2001) und dehnungsaktivierte Ca2 + -Kanäle spielen bei der Fibroblastenmigration eine Rolle (Munevar et al., 2004). Unter Verwendung der Zugkraftmikroskopie haben Dembo und Mitarbeiter bedeutende Fortschritte beim Verständnis der Rolle der Krafterzeugung bei der Fibroblastenmigration erzielt.
Einer der bedeutendsten technischen Fortschritte bei der Verwendung von Polyacrylamidgel ist die Fähigkeit, die Compliance des zellulären Substrats zuverlässig zu kontrollieren, ohne die ECM-Dichte zu verändern. Die Abstimmung der Konformität des Substrats war ein kritischer Wendepunkt in der Entwicklung der Traktionskraftmikroskopie, da sie die Untersuchung nahezu jedes Zelltyps und ein Verständnis des Zellverhaltens als Funktion der mechanischen Umgebung ermöglichte. Vor der Studie von Pelham und Wang (1997) konzentrierten sich die meisten Studien zur Untersuchung der Zellmigration und -adhäsion auf die Zellmigration als Reaktion auf ihre lösliche chemische Umgebung (Chemotaxis) oder als Reaktion auf den an das Substrat konjugierten Liganden (Haptotaxis). Darüber hinaus konzentrierten sich Studien mit der mechanischen Umgebung der Zelle auf die Reaktion aufgrund von Kräften wie Flüssigkeitsscherspannung und mechanischer Dehnung. Durch die Veränderung der Steifigkeit des Substrats haben Pelham und Wang (1997) jedoch eine signifikante Veränderung in der Art und Weise bewirkt, wie Forscher zelluläre Reaktionen und Mechanotransduktion angehen. Unter Verwendung von Polyacrylamidsubstraten hielten Pelham und Wang die ECM-Dichte auf dem Substrat konstant und änderten gleichzeitig die mechanische Nachgiebigkeit. Sie zeigten, dass Fibroblasten in der Lage sind, aktiv auf die mechanische Nachgiebigkeit ihres Substrats zu reagieren. Zellen auf steiferen Gelen sind stärker verbreitet und wandern langsamer als Zellen auf nachgiebigeren Gelen. Darüber hinaus spiegelt sich die Fähigkeit von Zellen, die mechanische Nachgiebigkeit ihres Substrats zu erfassen, in ihrer Fähigkeit wider, den Phosphorylierungszustand zahlreicher Proteine zu verändern, die in der fokalen Adhäsionsstruktur enthalten sind. Fokale Adhäsionen auf steifen Substraten sind größer, länglicher und stabiler, während fokale Adhäsionen auf nachgiebigeren Substraten weniger phosphoryliertes pp125FAK und Paxillin enthalten und viel unregelmäßiger erscheinen. Diese Ergebnisse waren die ersten, die darauf hindeuteten, dass mechanische ECM-Signale bei der Regulierung der Zelladhäsion genauso wichtig sein könnten wie chemische Signale.
Seit dem wegweisenden Artikel von Pelham und Wang (1997) haben eine Reihe von Studien die Auswirkungen der Compliance auf das Zellverhalten untersucht. In: Lo et al. (2000) verwendeten Polyacrylamidchemie, um ein Substrat zu erzeugen, das einen Steifigkeitsschritt enthält — einen zentralen Bereich des Substrats, in dem sich zwei Substrate unterschiedlicher Konformität treffen. Sie zeigten ein Verhalten namens Durotaxis, durch das die Zellen Veränderungen in der Compliance des Substrats aktiv erkennen und darauf reagieren konnten. Zellen, die auf dem weichen Substrat migrierten, würden beim Auftreffen auf die Grenze des Steif–Weich–Übergangs auf das steife Substrat übergehen, während Zellen auf steifen Substraten höhere Traktionen und mehr Ausbreitungsfläche aufwiesen und entweder zurückzogen oder die Richtung änderten als Reaktion auf die steif-Weich-Grenze. Später, Wong et al. (2003) untersuchten die Fähigkeit von Fibroblasten, auf Polyacrylamidhydrogelen zu migrieren, die Gradienten der Compliance anstelle eines Schrittes enthielten, wie dies von Lo und Mitarbeitern getan wurde. Sie fanden heraus, dass vaskuläre glatte Muskelzellen dazu neigen, auf weicheren Substraten schneller zu wandern als auf steiferen Substraten (15 kPa gegenüber 25 kPa), und dass Zellen dazu neigen, sich auf steiferen Substraten anzusammeln. Darüber hinaus schien das Migrationsmuster auf gradientenkonformen Gelen eher auf die steiferen Gelregionen gerichtet zu sein als das typische Random-Walk-Muster, das für die Zellmigration charakteristisch ist. In: Engler et al. (2004) untersuchten die Zellantwort auf konforme Gele weiter und zeigten, dass die Reaktion zu einem großen Teil durch den Aufbau des Aktin-Zytoskeletts vermittelt wird. Durch Tests auf Veränderungen im Zytoskelett konnten Engler und Mitarbeiter zeigen, dass eine leichte Überexpression von Aktin in der Zelle den Ausbreitungsverlust in weichen Gelreaktionen kompensieren kann. Darüber hinaus Yeung et al. (2005) zeigten, dass die Empfindlichkeitsschwelle für die Compliance–Erkennung zelltypspezifisch ist und dass Zell-Zell-Kontakte auch dazu beitragen können, die in den weichen Substraten beobachteten Morphologieveränderungen der Morphologie von Zellen auf steiferen Substraten ähnlicher zu machen (Yeung et al., 2005). Insgesamt ist das Studium der Durotaxis noch relativ jung, und es bleibt noch viel darüber zu lernen, wie eine Zelle mechanisch die Materialeigenschaften ihres Substrats und ihrer Umgebung wahrnimmt und darauf reagiert.
