2.3.4.1 Die Struktur
Das Homodimer apo-sCTLA-4 wurde als thrombin-spaltbares Fc-Fusionsprotein in CHO-Zellen in Gegenwart von Kifunensin exprimiert.23 Nach der Deglykosylierung lieferte das Homodimer Kristalle, die zu Bragg-Abständen von 1,8 Å mit Einheitszellenabmessungen von a = 43,86 Å, b = 51,46 Å und c = 102,85 Å und der Raumgruppe P212121 (Ref. 130). Die Struktur wurde durch molekularen Ersatz gelöst. Die asymmetrische Einheit umfasste ein disulfidgebundenes Homodimer, das Vergleiche mit den Komplexen sCTLA-4 / sB7-1 und sCTLA-4 / sB7-2 sowie mit sCTLA-4, das an ein konstruiertes Lipocalin gebunden war, ermöglichte.131
Die beiden Monomere in der asymmetrischen Einheit bestanden aus β-Sandwich-Domänen mit AGFCC‘- und ABED-Topologie, wie von Metzler et al.132 Ein kurzer „Stiel“ mit acht Rückständen, der an Cys122 disulfidgebunden ist, verband die IgSF-Domänen mit der Membran. Unerwarteterweise waren die beiden Hälften des apo-CTLA-4-Homodimers einander weniger ähnlich als ihren komplexierten Gegenstücken, was betont, dass die Bindung nicht mit großflächigen strukturellen Umlagerungen einhergeht (Abb. 2,2 H). Automatisierte Strukturvergleiche identifizierten CD28 und PD-1 als die Strukturen, die CTLA-4 am ähnlichsten sind. Wichtige Unterschiede zwischen CTLA-4 und CD28 waren: (i) das Vorhandensein eines Knicks im β-Strang G von CD28, (ii) Änderungen der Schleifengröße einschließlich verlängerter AB-, BC- und CC‘-Schleifen in CTLA-4 und einer abgeschnittenen C“D-Schleife und (iii) H-Bindung der C‘- und C“β-Stränge infolge der Neupositionierung der C’C“ -Schleife in CD28. Von zentraler Bedeutung war die weitgehend identische Konformation der FG-99MYPPPY104-Sequenz, die den Kern ihrer Ligandenbindungsflächen bildet. Nur ein einziges Wassermolekül konnte in der ungewöhnlich trockenen Ligandenbindungsoberfläche von apo-CTLA-4 gefunden werden, während an anderer Stelle 228 Wasser nachgewiesen wurden.
Nach CD28 und PD-1 waren die nächstähnlichsten Strukturen der CTLA-4-V-Set-Domäne 215 Antikörper- oder TCR-V-Domänen, die sich hauptsächlich nur in den Schleifenlängen unterschieden. Der RMS-Unterschied für die Überlagerung von CTLA-4 mit der ähnlichsten TCR-Va-Domäne betrug 2,09 Å für 102 Reste, im Gegensatz zu 2,89 Å für 86 Reste für die Überlagerung mit d1 von CD2. Wichtige gemeinsame Merkmale mit der Va-Domäne waren die lange CC ‚-Schleife und konservierte β-Ausbuchtungen in den C‘- und G-β-Strängen, die dem AGFCC‘-β-Blatt eine ausgeprägte Verdrehung verleihen. Besonders bemerkenswert war der hohe Grad an Sequenzerhaltung und Ca-Konformation in der Nähe der G-Strang-β-Ausbuchtung, dh GNGTQIYV (CTLA-4) und GDGTQLVV (Va). In CD2 und CTLA-4 waren die Schleifen ähnlich und die Domänen unterschieden sich insofern: (i) in CD2 gab es keine H-Bindung der ßA- und ßB-Stränge, (ii) es gab keine Verdrehung des A’GFCC‘ β-Blattes in CD2 aufgrund einer Neupositionierung der β-Ausbuchtungen, (iii) die Position des C „β-Strangs in CD2, aber nicht CTLA-4 erlaubte eine kanonische H-Bindung und Verlängerung des AGFCC’C“ β-Blattes, und (iv) CTLA-4 fehlte die Verdrehung in der in CD2 vorhandenen FG-Schleife (und auch z. B. B7 -1). Die Analyse von zweiundfünfzig V-Set-IgSF-Domänen unter Verwendung eines sequentiellen Strukturausrichtungsprogramms133 zeigte, dass die CD28 / CTLA-4-Familie eine Untergruppe von V-Set-Domänen umfasst, die sich von den Gruppierungen von CD8, Antigenrezeptoren und „Adhäsions“ -Molekülen unterscheiden, beispielsweise B7-1 und CD2. Insgesamt gab es eine größere Ähnlichkeit der CD28 / CTLA-4-Untergruppe mit der Antigenrezeptorfamilie im Vergleich zum Adhäsionssatz. Die Analyse ergab, dass Proteine der CD28 / CTLA-4-Familie und Antigenrezeptoren einen gemeinsamen Vorfahren hatten, der möglicherweise PD-1 ähnelt, wobei die beiden Familien früh auseinander gingen.
Apo-CTLA-4 umfasste ein Homodimer, dessen Untereinheiten eine Anordnung annahmen, die orthogonale bivalente Wechselwirkungen mit Liganden begünstigte, die auf apposierenden Zelloberflächen positioniert waren. Vergleiche mit den CTLA-4-Monomerpaaren in den B7-1- und B7-2-Komplexen106,107 und dem Monomer im Lipocalin-komplex131 zeigten eine sehr begrenzte Rotationsflexibilität an der Homodimergrenzfläche und bemerkenswert wenige, wenn überhaupt, Änderungen, die auf die Ligandenbindung zurückzuführen sind. Die einzigen Unterschiede zeigten sich im B7-2-Komplex mit einer leichten Neupositionierung der BC- und CC ‚-Schleifen sowie des C „β-Strangs und benachbarter Schleifen und Konformationsunterschieden im G β-Strang an seinem C-Terminus. Diese lokalen Variationen waren von der Ligandenbindungsstelle von CTLA-4 entfernt und in keinem Fall unterschieden sich die Apo-Monomere systematisch von allen fünf komplexierten CTLA-4-Monomeren. Die Hauptkettenatompositionen der 99MYPPPY104-Sequenz waren im Wesentlichen identisch.
Die Strukturen der von CTLA-4 gebildeten Komplexe mit B7-1 und B7-2, die zuvor nicht verglichen worden waren, waren ziemlich unterschiedlich.130 Substitution in B7-2, von Val28 vs Arg29 in B7-1, bildete eine Bindungstasche in B7-2, die nur teilweise von CTLA-4 gefüllt wurde. Dies stellte sicher, dass der B7-1 / CTLA-4-Komplex eine bessere Formkomplementarität aufwies als der B7-2 / CTLA-4-Komplex. Um dies etwas auszugleichen, war die von CTLA-4 in B7-2 vergrabene Oberfläche etwas größer als die von B7-1. Insgesamt hat B7-1 CTLA-4 noch steifer körperartig gebunden als CTLA-4 B7-1. Die Bindung von B7-2 durch CTLA-4 war, jedoch, komplexer und trug das Markenzeichen von „induced fit.“ In CTLA-4 bound- vs apo-B7–2 gab es eine 2,3-3,5 Å Verschiebung der B7-2 FG Schleife in Richtung CTLA-4, die durch eine ~ 120 Grad Drehung von Phe31 von B7-2 initiiert wurde (Ref. 130). Dies führte zu einer Stapelinteraktion von Phe31 mit Pro102 der 99MYPPPY104-Sequenz von CTLA-4.
