Kluyveromyces marxianus Entwicklung einer Ethanoltoleranz während der adaptiven Evolution mit signifikanten Verbesserungen mehrerer Wege

Verbesserte Resistenz gegen Ethanol nach einer 100-tägigen Evolution

Der haploide Wildtyp-Stamm K. marxianus wurde 100 Tage lang in Medium mit 6% (v / v) Ethanol bei 30 ° C kultiviert etwa 450 Generationen (siehe Methoden für Details). In diesem Zeitraum gab es einen kontinuierlichen Anstieg der Biomasse (gemessen mit OD600 täglich) (Abb. 1a), was darauf hindeutet, dass das Überleben der Zellen unter Ethanolstress verbessert werden kann. Am Ende erhielten wir eine K. marxianus-Population mit stark verbesserter Resistenz gegen Ethanol (Abb. 1b). KM bezieht sich auf den rohen Stamm vor der Evolution und KM-100d bezieht sich auf die K. marxianus-Population nach der 100-tägigen Evolution. Die maximale Ethanolelastizität für KM betrug 7% (v / v) und für KM-100d bis zu 10% (Abb. 1b). Wir verglichen Wachstumsprofile zwischen KM und KM-100d in Kulturmedien mit unterschiedlichen Ethanolgehalten (0%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% v/v, Fig. 1c). In Abwesenheit von Ethanol gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen den Stämmen. Ihr Unterschied nahm mit dem Anstieg des Ethanolspiegels zu und erreichte das Maximum mit 6% (v / v) Ethanol in Kulturmedien. Unter solchen Umständen war die Biomasse von KM-100d nach 48 h fast doppelt so hoch wie die von KM. Beide Stämme zeigten ein verzögertes Wachstum im Medium mit 7% Ethanol und konnten im Medium mit 8% Ethanol nicht wachsen. Darüber hinaus zeigte KM-100d auch eine bemerkenswert höhere maximale Wachstumsrate als KM bei 6% Ethanol (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S1).

K. marxianus Entwicklung in 6% (v/v) Ethanol. ein täglicher OD600-Wert der K. marxianus-Population während der Evolution. Die Zellen wurden jeden Tag übertragen und in ein frisches Medium mit 6% (v / v) Ethanol mit dem gleichen anfänglichen OD600 von 0,6 subkultiviert. Dann wurde nach Inkubation bei 30 ° C in einem Orbitalschüttler für 24 h OD600 gemessen, um das Zellwachstum aufzuzeichnen. b ) Verdünnungsanalyse auf Ethanoltoleranz zwischen Vor- und Nachentwicklung. KM- und KM-100d-Zellen wurden auf flüssigem Medium mit Ethanol bei einer der Gradientenkonzentrationen inokuliert: 0, 1, 2,…, 11% ( v/v) und 3 Tage bei 30°C inkubiert. Eine Zellsuspension von 10 OD600 aus dem flüssigen Medium wurde 5fach seriell verdünnt und auf eine YPD-Platte getupft und 2 Tage bei 30°C kultiviert. c Wachstumsprofile von KM und KM-100d bei unterschiedlichen Ethanolkonzentrationen. Die rote Kurve ist für KM-100d, und die schwarze ist für KM. Während der Wachstumsprofilmessung wurden KM und KM-100d beide in biologischem Dreifach durchgeführt

DNA-Analysen legen nahe, dass K. marxianus während der adaptiven Evolution keine Veränderung der Ploidie oder kritischer Gene aufweist

Um DNA-Veränderungen in KM-100d aufzuklären, führten wir DNA-Ploidie-Analysen und DNA-Mutationsidentifikationen durch. Während der adaptiven Evolution hat sich der DNA-Gehalt der K. marxianus-Population kaum verändert (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S2); somit fand keine Ploidieänderung statt. Durch DNA-seq-Analyse von KM und KM-100d, die beide auf das Referenzgenom von K. marxianus DMKU 3-1042 abgebildet wurden, wurden die SNP-Stellen zwischen KM und KM-100d erhalten (Zusätzliche Datei 2). Unter den identifizierten 57 SNPs waren nur 4 Standorte in der KM-100d-Population dominant. Drei von ihnen befinden sich in der kodierenden Region von SAN1-, YAP1- und KHT2-Genen; der andere befindet sich am 445 bp stromaufwärts von ERG26. Die 1324-Stelle von SAN1 wurde von C zu T mutiert, und folglich wurde die entsprechende Aminosäure von Arginin zu Cystein transformiert. Doch nach der Analyse der Pfam 32.0, diese Mutation fällt nicht in eine identifizierte Proteindomäne. Sowohl die Mutationen in YAP1 als auch in KHT2 sind synonyme Mutationen ohne Proteinveränderung. Die obigen Ergebnisse legen nahe, dass Veränderungen im DNA-Kontext bei weitem nicht ausreichen, um eine solche Phänotypverbesserung bei KM-100d zu unterstützen, und die transkriptionelle Umprogrammierung muss dazu beitragen. Daher haben wir weiter eine RNA-seq-Analyse durchgeführt.

Eine globale Neuverkabelung, die durch die 100-Tage-Evolution induziert wurde

Um die Ethanoltoleranz gründlich zu verstehen, führten wir eine RNA-seq-Analyse durch, um die Genexpression der KM- und KM-100d-Hefen zu vergleichen, die in Medien mit 4% und 6% (v / v) Ethanol wuchsen. Basierend auf den Wachstumsprofilen (Abb. 1c) wurde beobachtet, dass die Wachstumsfähigkeit zwischen KM-100d und KM den maximalen Unterschied bei 48 h aufwies; Daher wurden Proben bei 48 h für die RNA-seq-Analyse gesammelt. Einstellung /log2ratio/ ≥ 1 und p-Wert < 0.05 als Kriterium für die Definition signifikant differentiell exprimierter (DE) Gene führten wir die DE-Genidentifikation in sieben Gruppen durch (Abb. 2, bezeichnet als 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 bzw. 7). In jeder Gruppe wurde die DE-Analyse gemäß dem auf die Kontrolle zeigenden Pfeil durchgeführt. Zusätzliche Datei 3 enthält Expressionswerte und differentielle Expressionsstatistiken aller Gene. Es gibt einen globalen Expressionsunterschied zwischen KM und KM-100d, wenn beide in einem ethanolfreien Medium wuchsen (Abb. 2 Gruppe ①). KM-100d-Hefen haben 1342 Gene mit höherer Expression als die KM-Hefe, während nur 188 Gene eine geringere Expression aufweisen. In Medien mit 4% und 6% (v / v) Ethanol ist die Anzahl der hochregulierten Gene in KM-100d stark auf 415 (Gruppe ②) bzw. 453 (Gruppe ③) reduziert. Die hochregulierten Genzahlen sind jedoch immer noch viel höher als die mit geringerer Expression (104 bzw. 182 Gene). Diese Ergebnisse legen nahe, dass KM-100d-Hefen transkriptionell neu verdrahtet werden, indem sie eine große Anzahl von Genen aktivieren. Der Vorschlag wurde weiter durch die Ethanol-induzierten Expressionsänderungen innerhalb der KM- und KM-100d-Hefen unterstützt. Unter Induktion von 4% und 6% (v /v) Ethanol weisen die KM-Hefen 1452 und 1465 hochregulierte Gene (Gruppen ⑥ und ⑦) auf, während die KM-100d-Hefen nur 631 bzw. 596 hochregulierte Gene (Gruppen ④ und ⑤) aufweisen. Darüber hinaus haben wir Heatmap angewendet.2 software im R-Paket zum Clustern von Genen und Gruppen basierend auf log2ratio-Werten (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S3) und fand heraus, dass das gendifferentielle Expressionsprofil in Gruppe ① dem von Gruppe ⑦ nahe kommt. Zusammengenommen behielten die KM-100d-Hefen viele Ethanol-induzierte Expressionsmerkmale bei, selbst wenn sie in einem ethanolfreien Medium wuchsen. Die Eigenschaften machen die entwickelte Zelle anpassungsfähiger für die kommende Ethanolstimulation, dh KM-100d-Hefe muss nicht so viele Gene aktivieren wie KM.

Globale Analyse von RNA-seq-Daten in KM und KM-100d unter Ethanolbelastung. In dieser Abbildung haben wir RNA-seq-Daten für die gendifferentielle Expressionsanalyse kompartimentiert. KM und KM-100d wurden im linken bzw. rechten Teil dargestellt, und die Ethanolkonzentrationen 0%, 4% und 6% (v / v) wurden in Reihen angeordnet. RNA-seq-Daten wurden in sieben Gruppen unterteilt, die als ①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥ und ⑦ bezeichnet wurden. In jeder Gruppe, Ein Pfeil zeigt auf die Kontrolle zur differentiellen Expressionsidentifikation, und die roten Ziffern bezeichnen die hochregulierte Gennummer, während die grünen die herunterregulierte Zahl darstellen

Anschließend führten wir in jeder Gruppe eine GO-Anreicherungsanalyse (Gene Ontology) für DE-Gene durch (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S4) und fanden heraus, dass die angereicherten GO-Terme ein breites Spektrum zellulärer grundlegender physiologischer Prozesse abdeckten, einschließlich Ribosomenbiogenese, Aminosäurebiosynthese, DNA-Reparatur, RNA-Verarbeitung usw., aber nicht direkt relevant für die Ethanolresistenz. Daher haben wir uns im Folgenden besonders auf Wege konzentriert, die stark mit dem Ethanolstoffwechsel und der Toleranz assoziiert sind, indem wir die assoziierten DE-Gene analysiert haben (Zusätzliche Datei 4).

KM-100d enhanced ethanol usage

Um die graphische Darstellung zu erleichtern, wurden die log2ratio-Werte der beteiligten DE-Gene (Zusätzliche Datei 4) in fünf Intervalle unterteilt: 1 ~ 2, 2 ~ 3, 3 ~ 4, 4 ~ 5, 5 ~ 6 ( und oben), wie in Fig. 3.

Mögliche Ethanolverbrauchsrouten in K. marxianus. In dieser Figur wird Ethanol sowohl im Zytoplasma (oberer Teil) als auch in den Mitochondrien (unterer Teil) verbraucht. Das blaugraue Rechteck kennzeichnet das beteiligte Gen, und die Gruppen ①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥ und ⑦ stimmen mit diesen Definitionen in Abb. 2. Rot und Grün in der Gruppennummer bezeichnen die Aufwärts- und Abwärtsregulation des Gens. Die Farbintensität repräsentiert den Grad der Genexpressionsveränderung, die Übereinstimmung von Farbe und log2ratio-Wert wird durch den Farbbalken in der oberen linken Ecke der Abbildung quantifiziert

Der Unterschied zwischen KM und KM-100d im Ethanolverbrauch wurde untersucht. Wie in Fig. 3, zwei routen können existieren für direkt verbrauchen ethanol, und wurden sowohl up-geregelt in KM und KM-100d, wenn konfrontiert ethanol (Gruppen ④, ⑤, ⑥, und ⑦). Ein Weg ist über cytoplasmatisches ADH6, das Ethanol zu Acetaldehyd katalysiert, erleichtert durch NADP +. Der andere ist durch mitochondriales ATF1, das die Ethanolveresterung mit Hilfe von Acetyl-CoA fördert. Insbesondere in KM-100d unter Ethanolstress (Gruppen ④ und ⑤) wurde YGL039W hochreguliert, um mehr NADP + zu erzeugen, und kann somit mehr Coenzyme zur Umwandlung von Ethanol in Acetaldehyd liefern, um die Ethanoltoxizität zu verringern. In Mitochondrien, zum Beispiel bei Ethanolstress (Gruppen ⑥ und ⑦), wurden nur C2E1P301 und ADH4 hochreguliert. Während in KM-100d während des Prozesses vom Äthanol zum Aldehyd zum Azetat, C2E1P301, ALD4, ADH3, ADH4 und ALD6 alle hochreguliert wurden (Gruppe ①). Die oben genannten Änderungen deuten darauf hin, dass KM-100d eine neuartige Fähigkeit erwerben könnte, die Ethanoltoxizität durch Erhöhung des Ethanolverbrauchs zu lindern. Die Theorie erklärt, dass KM-100d über KM in Medium mit Ethanol durchgeführt.

KM-100d verbesserte membran lipid biosynthese, anti-osmotischen druck, anti-oxidativen stress, und protein folding zu widerstehen ethanol stress

Neben verbraucht, die angesammelt ethanol direkt einflüsse zelle membran integrität, verändert innere-und äußere-osmotischen druck, stört protein konformation, und induziert reaktiven sauerstoff arten (ROS) generation, wodurch ernsthafte schäden an hefe zelle. Im Folgenden analysierten wir DE-Gene in diesen Pfaden für anti-Ethanol-verursachte Schäden in K. marxianus (Abb. 4).

Ein schematisches Diagramm für Anti-Ethanol verursachte Schäden in K. marxianus. Im linken Teil dieser Figur übt angesammeltes Ethanol im Medium einen osmotischen Druck auf die Hefezelle aus und aktiviert anschließend den osmotisch ansprechenden Weg. Im mittleren Teil dringt Umweltethanol in die Zelle ein und stört die Zellmembran. Im rechten Teil werden Zellmembranlipide synthetisiert, um die beschädigte Zellmembran zu stärken und zu reparieren. Im unteren Teil stört Ethanol die Proteinkonformation und verursacht oxidativen Stress, wodurch die zugehörigen Sensoren und Antwortwege aktiviert werden. Die Gruppenzahlen und Farben für die differentielle Expression des Gens stimmen mit denen in Abb. 3

Nach ethanolgetriebener Evolution wurde der Alkoholstressreaktionsweg in KM-100d aktiviert. ASR1, das bei Ethanolexposition vom Zytoplasma zum Zellkern transloziert, und ETP1, das als zytoplasmatisches Retentionsprotein mit einer Rolle bei der ethanolabhängigen transkriptionellen Aktivierung von Hitzeschockproteingenen wirkt, wurden beide in KM-100d hochreguliert (Gruppe ①) und teilweise hochreguliert in KM-Ethanol (Gruppen ⑥ und ⑦), was darauf hindeutet, dass KM-100d selbst in einem ethanolfreien Medium Reaktionswege für die Ethanolherausforderung vorbereiten kann, genau wie die Reaktion von KM auf Ethanol.

Die Bildung von Membranlipid spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Integrität der Zellmembran unter oxidativem Stress . Ungesättigte Fettsäuren, die Schlüsselkomponenten in der Zellmembranstruktur, sind eng mit der Ethanoltoleranz verwandt . In Fig. 4, von Acetyl-CoA zur ungesättigten Fettsäurebiosynthese zum Einbau in Phospholipid, die beteiligten Gene PPT2, FAD2 und TAZ1 wurden alle in KM-100d hochreguliert (Gruppe ①), was darauf hindeutet, dass KM-100d nach der Evolution bereits die ungesättigte Fettsäurebiosynthese verbessern kann, um mehr Rohstoffe für die Zellmembranbiogenese zu liefern. Und die Herunterregulierung der Gene ACC1, TSC13, FAS1 in KM, die in Ethanol exponiert sind (Gruppen ⑥ und ⑦), stimmt mit dem vorherigen Bericht überein , der für die schwache Ethanoltoleranz von K. marxianus vor der adaptiven Evolution verantwortlich sein könnte.

Eine große Anzahl von Genen, die mit der Zellmembranlipidbiogenese assoziiert sind, einschließlich Phosphoglycerid, Sphingolipid und Sterin, wurden unter Ethanolstress differentiell exprimiert (Abb. 4). Insbesondere Gene, die an der Phosphoglycerid-Biosynthese beteiligt sind, wurden im Allgemeinen in KM-100d (Gruppe ①) und in KM-2-Ethanol (Gruppen ⑥ und ⑦) hochreguliert, was darauf hindeutet, dass Phosphoglycerid die Hauptkomponente in der Zellmembran für die Ethanolresistenz sein kann. Für die Sterolbiosynthese wurden viele Gene (z. B. ERG9 und ERG7) in den Gruppen ④ und ⑥ herunterreguliert, und mehrere Gene wurden in Gruppe ⑤ (z. B. ERG25) und Gruppe ⑦ (z. B. ERG26) hochreguliert, was darauf hindeutet, dass die Sterolbiogenese wichtig sein kann, um hohem Ethanol standzuhalten, aber nicht für niedriges Ethanol. Darüber hinaus wurden die Gene CKI1, ERG2 und ERG25, die an der Phosphoglycerid- und Sterolbiosynthese beteiligt sind, nur in Gruppe 1 hochreguliert; Dies könnte einer der Hinweise auf die bessere Leistung von KM-100d als KM in hohem Ethanol sein.

Eine hohe Ethanolkonzentration in einem Medium führt zu osmotischem Stress auf Hefezellen . Wie in Fig. 4 wurden die osmotischen Plasmamembransensoren (SLN1, OPY2 und SHO1) und Gene (HOG1, SSK1 und SSK2), die an dem nachgeschalteten Reaktionsweg beteiligt waren, alle in KM hochreguliert ausgesetzt in niedrigem Ethanol (Gruppe ⑥) und einzeln hochreguliert in KM-100d (Gruppe ①), in KM-100d hohem Ethanol (Gruppen ④ und ⑤) und in KM mit hohem Ethanol (Gruppe ⑦). Die Glycerinproduktion ist ein wichtiger Weg für S. cerevisiae, dem osmotischen Druck zu widerstehen. Als KM und KM-100d mit Ethanol konfrontiert wurden, waren die meisten Gene, die mit der Biogenese von Glycerin zusammenhängen, herunterreguliert. Die obigen Ergebnisse legen nahe, dass vor und nach der Evolution, K. marxianus hat immer Wege zur Erfassung und Transduktion osmotischer Stresssignale; Seine Strategie zur Resistenz gegen osmotischen Stress beruht jedoch möglicherweise nicht auf dem Glycerinproduktionsweg.

Die Zellwand bietet eine ausreichende mechanische Festigkeit, damit die Zelle dem osmotischen Druck standhält , und der sekretorische Weg transportiert nicht nur Zellwandproteine nach außen, sondern überträgt auch Lipide auf die Plasmamembran, um die Membranstruktur zu stärken. Wir analysierten DE-Gene im sekretorischen Weg und in der Zellwandbiogenese (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S5). Gene, die am sekretorischen Weg und an der Zellwandbiogenese beteiligt sind, wurden im Allgemeinen in KM-100d (Gruppe ①) hochreguliert, und einige von ihnen wurden auch in KM-1 in Ethanol hochreguliert (Gruppen ⑥ und ⑦). Es impliziert, dass KM-100d nicht nur die Hochregulierung des sekretorischen Weges für KM aufrechterhielt, sondern auch den Aktivierungsumfang des sekretorischen Weges zur Vorbereitung des Ethanolangriffs erheblich vergrößerte; daher kann die Verbesserung des sekretorischen Weges und der Zellwandbildung die neue Strategie sein KM-100d entwickelt, um Ethanol-verursachten osmotischen Stress zu ertragen. Auf der anderen Seite waren für KM und KM-100d, die in niedrigem Ethanol (Gruppen ④ und ⑥) exponiert waren, viele Gene im sekretorischen Weg beide herunterreguliert, was darauf hindeutet, dass die Aktivierung des sekretorischen Weges möglicherweise nicht der notwendige Weg für K. marxianus ist, der auf niedriges Ethanol reagiert.

Gegen den durch Ethanol ausgelösten oxidativen Stress (Abb. 4), HYR1, das als Sensor und Wandler der Hydroperoxidspannung fungiert, wurde in KM und KM-100d hochreguliert, die beide in hohem Ethanol ausgesetzt waren (Gruppen ⑤ und ⑦). Die auf oxidativen Stress reagierenden Transkriptionsfaktoren SKN7 und STB5 wurden in KM-100d (Gruppe ①) und in KM-hohem Ethanol (Gruppe ⑦) hochreguliert. Für antioxidativen Stress wurden Gene, die am Superoxiddismutasesystem beteiligt sind (z. B. MTM1 und PRX1), im Allgemeinen in KM-100d hochreguliert, entweder in Ethanol exponiert oder nicht (Gruppen ①, ④ und ⑤). Für das Thioredoxinsystem können Gene (z.B., MXR1 und TRR1) wurden in KM hochreguliert und KM-100d stand beide vor Ethanol. Es wurde auch berichtet, dass Thioredoxin und seine Reduktase die Toleranz von K. marxianus gegenüber mehreren von Lignocellulosen abgeleiteten Inhibitoren erhöhen . Für das Glutaredoxinsystem wurden die Gene GRX2 und GLR1 nur in KM-100d hochreguliert, die in hohem Ethanol exponiert waren (Gruppe 1). Für die Peroxisom-Biogenese wurden Gene wie PEX6 und PEX7 in KM-100d (Gruppe ①) hochreguliert, und einige andere Gene (z. B. PEX3 und INP2) wurden in KM und KM-100d herunterreguliert, wenn sie mit niedrigem Ethanol konfrontiert wurden (Gruppen ④ und ⑥). Das Obige impliziert, dass KM-100d die Antioxidationsfähigkeit global stärken kann.

Um eine korrekte Proteinfaltung unter Ethanolstress zu gewährleisten (Abb. 4), der Hitzeschock-Transkriptionsfaktor HSF1 wurde in KM und KM-100d mit niedrigem Ethanol (Gruppen ④ und ⑥) hochreguliert, eine Reihe von Chaperon-verwandten Genen (z. B. PFD1 und CPR7) wurden in KM hochreguliert mit Ethanol (Gruppen ⑥ und ⑦), auch in KM-100d (Gruppe ①) hochreguliert. Einige Gene (z. B. CPR4), die in KM-Ethanol herunterreguliert wurden, waren in KM-100d nicht herunterreguliert. Daher kann KM-100d im Allgemeinen die Proteinfaltung verbessern, um eine stabilere zelluläre Umgebung bereitzustellen.

Es wurde berichtet, dass bei S. cerevisiae die Trehaloseakkumulation für die Ethanoltoleranz wichtig war, da Trehalose als kompatibler gelöster Stoff wirkt, um den Zustrom überschüssiger Salze in Hefezellen zu verhindern ; Unterdessen wurden Gene, die am Trehaloseabbau beteiligt sind, auch durch Ethanol induziert, um es auf die optimale Konzentration einzustellen . Für K. marxianus (Abb. 4) fanden wir heraus, dass Gene, die an der Trehalose-Biosynthese und -degradation beteiligt sind (z., NTH1 und TSL1) wurden bei Behandlung mit niedrigem Ethanol (Gruppen ④ und ⑥) häufig hochreguliert, bei Exposition mit hohem Ethanol (Gruppen ⑤ und ⑦) jedoch im Trehalosestoffwechsel nicht hochreguliert. Dies deutet darauf hin, dass bei K. marxianus die Trehaloseakkumulation eine spezielle Strategie zur Bewältigung von niedrigem Ethanol sein kann, nicht jedoch für hohes Ethanol.

Die differentiellen Expressionen von 15 Genen, die an den obigen Ethanol-toleranten Signalwegen beteiligt sind, wurden mit RT-qPCR-Analyse validiert (Abb. 5). Genexpression in Gruppe ① (Abb. 5a) wurden im Allgemeinen hochreguliert. Andererseits ist die Hochregulation von Genen in Gruppe ④ (Abb. 5d) und Gruppe ⑤ (Fig. 5e) war nicht so hoch wie in Gruppe ⑥ (Fig. 5b) und Gruppe ⑦ (Fig. 5c). Unsere Analyse bestätigte, dass Gene, die zur Ethanoltoleranz beitragen, in KM-100d auch nach Beendigung des Ethanolstresses kontinuierlich aktiviert werden. Die kontinuierliche Genexpression könnte hilfreich sein, um die intrazelluläre Umgebung zu stabilisieren und das Wachstum von Zellen bei anstehendem Stress zu fördern.

RT-qPCR-Analyse für die gendifferentielle Expression von KM und KM-100d in verschiedenen Gruppen. ein KM-100d vs. KM sowohl im ethanolfreien Medium. Dies ist für die DE-Genanalyse in Gruppe ①. b KM ausgesetzt in 4% (v / v) Ethanol vs. KM in einem ethanolfreien Medium. Dies ist für Gruppe ⑥. c KM ausgesetzt in 6% (v / v) Ethanol vs. KM in einem ethanolfreien Medium. Dies ist für Gruppe ⑦. d KM-100d ausgesetzt in 4% (v / v) Ethanol vs. KM-100d in einem ethanolfreien Medium. Dies gilt für Gruppenreisen. e KM-100d ausgesetzt in 6% (v / v) Ethanol vs. KM-100d in einem ethanolfreien Medium. Dies gilt für Gruppenreisen. In jeder Probe wurde 18S als interne Kontrolle verwendet. Gesamt-RNA wurde aus Zellen isoliert, die bei 48 h in biologischem Triplikat kultiviert wurden

Validierung des erhöhten Ethanolverbrauchs und der multiplen Stressresistenz in KM-100d

Wir haben das Wachstum von KM- und KM-100d-Hefen in YNB-Medium mit verschiedenen Kohlenstoffquellen überprüft (Abb. 6a). Sowohl die Hefen KM als auch KM-100d haben die gleiche Fähigkeit, Glukose als einzige Kohlenstoffquelle zu nutzen. In Gegenwart von 1% und 2% (v / v) Ethanol als einzige Kohlenstoffquelle wuchsen KM-100d-Hefen jedoch besser als KM-Hefen. Das Ergebnis unterstützt unsere oben erwähnte Hypothese, dass die KM-100d-Hefen Ethanol effizienter verwerten als die KM-Hefen.

Zellwachstumstest auf Ethanol und Zelllebensfähigkeit und Fermentation unter mehreren Belastungen. ein Zellwachstumstest von KM und KM-100d basierend auf Glucose oder Ethanol als Kohlenstoffquelle. Eine Zellsuspension von 10 OD600 wurde fünffach seriell verdünnt und mit Glucose oder Ethanol als einziger Kohlenstoffquelle auf eine YNB-Platte getupft und 2 Tage lang kultiviert, wie entlang von Säulen dargestellt. b-Zell-Viabilitätstest von KM und KM-100d unter thermischer Belastung. Die Temperaturen liegen bei 30 °C, 37 °C, 40 °C und 45 °C. c Zelllebensfähigkeitstest unter oxidativem Stress. H2O2 wurde als Oxidationsreiz verwendet und seine Konzentrationen betragen 0%, 0,04%, 0,06% und 0,08%. d Zelllebensfähigkeit unter osmotischem Druck. Hochsalz (NaCl) wurde verwendet, um osmotischen Druck mit Konzentrationen von 0 M, 0,5 M, 0,6 M und 0 zu verursachen.7 M. e Ethanolausbeute und Glucoseverwertung in KM und KM-100d im Grundzustand. f Ethanolausbeute und Glucoseverwertung unter 45 °C. g Ethanolausbeute und Glucoseverwertung unter 6% (v/v) Ethanolbelastung. h Ethanolausbeute und Glucoseverwertung unter 8% (v/v) Ethanolbelastung. In der Unterfigur b–d befinden sich KM und KM-100d in der ersten bzw. zweiten Reihe. Eine Zellsuspension von 10 OD600 wurde 5-fach seriell verdünnt und auf eine YPD-Platte getupft und 2 Tage kultiviert. Außer dem thermischen Test mit spezifizierten Temperaturen wurden alle anderen Tests bei 30 °C durchgeführt. In der Unterfigur e–h stellen die linke Y-Achse und die rechte y-Achse Glucosereste im Medium (schwarz bezeichnet) bzw. die Ethanolproduktion (blau bezeichnet) dar

Andererseits wird anhand der Fig. 4, KM-100d entwickelt möglicherweise Widerstand zum Äthanol-verursachten mehrfachen Druck gleichzeitig, einschließlich osmotischen Druck, oxidativen Druck und thermischen Druck (für die Hitzeschockproteine, die als Chaperone für Proteinfaltung genommen werden). Um die Toleranzen der Hefen gegenüber mehreren Belastungen zu bewerten, führten wir den Zelllebensfähigkeitstest für verschiedene Temperatur-, Oxidations- und osmotische Drücke durch (Abb. 6b-d). Im Grundzustand (d. h. 30 ° C, 0% H2O2 und 0 M NaCl) fehlt ein Unterschied der Lebensfähigkeit zwischen den Hefen KM und KM-100d. KM-100d-Hefen zeigen jedoch in Gegenwart der unterschiedlichen Belastungen eine signifikant bessere Lebensfähigkeit als die KM-Hefen. Ferner sind die Vorteile signifikanter, während die Spannungen schwerwiegender wurden (Abb. 6b-d). Wir erwarteten, dass die Toleranzen gegenüber Mehrfachbelastungen den Hefen bei der Ethanolproduktion neue Merkmale verleihen könnten.

Wir haben die Ethanolproduktivität zwischen den Hefen KM und KM-100d unter Mehrfachbelastungen weiter untersucht. Im Grundzustand (30°C und 0% Ethanol, Fig. 6e) sind die Hefen KM und KM-100d sowohl im Glukoseverbrauch als auch in der Ethanolproduktion nahezu gleich. Die KM-100d-Hefen zeigten jedoch signifikante Vorteile bei hohen Temperaturen (45 ° C, Abb. 6f) oder mehr Ethanol (6% oder 8%, Fig. 6g, h); die gemeinsame Umgebung fand normalerweise im späten Stadium der Fermentation statt. Wir führten eine RT-qPCR-Analyse für KM- und KM-100d-Hefen durch, die in Medien mit 6% Ethanol bei 48 h, 72 h und 120 h fermentiert wurden (Abb. 7). Die meisten dieser Ethanol-toleranten Gene wurden in KM-100d im Vergleich zu in KM hochreguliert, insbesondere im früheren Stadium (48 h) für die anfängliche Anpassung an Ethanol (Abb. 7). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die KM-100d-Hefen durch die Hochregulierung der Expression ethanoltoleranter Gene die KM-Hefen in stressigen Umgebungen mit erhöhten Ethanolerträgen übertrafen.

RT-qPCR-Analyse für Genexpression in KM und KM-100d während der Fermentation. ein KM-100d vs. KM beide bei 48 h in Gärung. b KM-100d vs. KM beide bei 72 h in Gärung. c KM-100d vs. KM beide bei 120 h in der Fermentation. In jeder Probe wurde 18S als interne Kontrolle verwendet. Sowohl KM als auch KM-100d wurden in Medien mit 6% Ethanol kultiviert. Gesamt-RNA wurde aus Zellen isoliert, die in biologischem Triplikat kultiviert wurden