1. KRAS Exon 2 (Codons 12/13) und Exon 3 (Codon 61) Mutationstest: Cobas® KRAS Mutationstest für In Vitro Diagnostika (Roche).
Der Cobas® KRAS Mutationstest ist ein Real-Time PCR Test zum qualitativen Nachweis von somatischen Mutationen in Exon 2 (Codons 12/13) und Exon 3 (Codon 61) des KRAS Gens mit einem DNA Input von 100 ng. Der Test kann 19 KRAS-Mutationen nachweisen. Das Vorhandensein von Mutationen wird mit einer analytischen Spezifität von mindestens 99% und einer Nachweisgrenze von mindestens 5% Mutantenniveau in einem Hintergrund von genomischer Wildtyp-DNA nachgewiesen.
Der Cobas® KRAS-Mutationstest basiert auf zwei Hauptprozessen: (1) manuelle Probenvorbereitung zur Gewinnung genomischer DNA aus einem oder zwei 5 µm dicken Abschnitten von FFPE-CRC-Gewebe, die mindestens 10% Tumorzellen enthalten; (2) PCR-Amplifikation der Ziel-DNA unter Verwendung komplementärer Primerpaare und zwei mit Fluoreszenzfarbstoff markierten Oligonukleotidsonden. Die verwendeten Primerpaare definieren eine 85-Basenpaarsequenz für Exon 2 mit den KRAS-Codons 12 und 13 und eine 75-Basenpaarsequenz für Exon 3 mit dem KRAS-Codon 61 in humaner genomischer DNA. Eine Sonde ist zum Nachweis der KRAS-Codon-12/13-Sequenz in Exon 2 und die andere Sonde zum Nachweis der KRAS-Codon-61-Sequenz in Exon 3 des KRAS-Gens ausgelegt. Der Mutationsnachweis erfolgt durch Schmelzkurvenanalyse mit dem Cobas z 480 Analysator (1).
2. KRAS-Mutationstest v2 (LSR)
Der KRAS-Mutationstest v2 (LSR) ist ein allelspezifischer Echtzeit-PCR-Test zum qualitativen Nachweis und zur Identifizierung von Exon 2-, 3- und 4-Mutationen im V-Ki-ras2 Kirsten Rat sarcoma Viral Oncogene Homolog (KRAS) -Gen aus formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe (FFPET). Der Test wurde entwickelt, um 28 einzigartige Mutationen zu erkennen. Das Vorhandensein von Mutationen wird mit einer analytischen Spezifität von mindestens 99% und einer Nachweisgrenze von mindestens 1% Mutantenniveau in einem Hintergrund genomischer Wildtyp-DNA nachgewiesen.
Der KRAS-Mutationstest v2 (LSR) basiert auf zwei Verfahren: (1) manuelle Probenvorbereitung zur Gewinnung genomischer DNA aus FFPET; und (2) PCR-Amplifikation und Nachweis von Ziel-DNA unter Verwendung komplementärer Primerpaare und mit Fluoreszenzfarbstoffen markierter Oligonukleotidsonden.
Der KRAS-Mutationstest v2 (LSR) verwendet Primer, die für jede der Zielmutationen spezifische Basenpaarsequenzen definieren. Die Amplifikation erfolgt nur in den Regionen des KRAS-Gens zwischen den Primern; das gesamte Gen wird nicht amplifiziert. Die anvisierten KRAS-Sequenzen reichen von 79 – 114 Basenpaaren. Der Mutationsnachweis erfolgt durch PCR-Analyse mit dem Cobas z 480 Analysator. (1)
3. BRAF / NRAS-Mutationstest (LSR)
Der BRAF / NRAS-Mutationstest (LSR) ist ein allelspezifischer Echtzeit-PCR-Test zum qualitativen Nachweis und zur Identifizierung von Exon 11- und 15-Mutationen im Proto-Onkogen B-Raf (BRAF) -Gen und Exon 2-, 3- und 4-Mutationen im Neuroblastoma RAS Viral Oncogene Homolog (NRAS) -Gen aus formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe (FFPET).
Der Test wurde entwickelt, um 36 einzigartige Mutationen zu erkennen. Das Vorhandensein von Mutationen wird mit einer analytischen Spezifität von mindestens 99% und einer Nachweisgrenze von mindestens 5% Mutantenniveau in einem Hintergrund von genomischer Wildtyp-DNA nachgewiesen.
Der BRAF / NRAS-Mutationstest (LSR) basiert auf zwei Hauptprozessen: (1) manuelle Probenvorbereitung zur Gewinnung genomischer DNA aus FFPET; und (2) PCR-Amplifikation und Nachweis von Ziel-DNA unter Verwendung komplementärer Primerpaare und Oligonukleotidsonden, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind.
Der BRAF/NRAS-Mutationstest (LSR) verwendet Primer, die spezifische Basenpaarsequenzen für jede der Zielmutationen definieren. Die Amplifikation erfolgt nur in den Regionen der BRAF- oder NRAS-Gene zwischen den Primern; Das gesamte Gen wird nicht amplifiziert. BRAF-Sequenzen reichen von 101 – 120 Basenpaaren. NRAS-Sequenzen reichen von 94 bis 121 Basenpaaren. Der Mutationsnachweis erfolgt durch PCR-Analyse mit dem Cobas z 480 Analysator. (2)
Klinische Implikation
KRAS und NRAS sind eng verwandte RAS-Onkogen-Familienmitglieder, und Mutationen in beiden Genen an den Codons 12, 13 (Exon 2), Codon 61 (Exon 3) und Codon 146 (Exon 4) führen zu erhöhten Spiegeln von Guanosintriphosphat-gebundenen RAS-Proteinen. Überaktive RAS-Signalisierung fördert die Onkogenese. Beim kolorektalen Karzinom (CRC) werden KRAS- und NRAS-Mutationen an diesen Codons in bis zu 50% der Fälle gefunden und sagen ein mangelndes Ansprechen auf die Anti-EGFR-Therapie voraus. Die meisten RAS-Mutationen sind Punktmutationen, die im KRAS-Exon 2 auftreten (Codons 12 oder 13; etwa 40%). Andere RAS-Mutationen sind seltener, wobei die häufigsten Mutationen in den KRAS-Exons 3 und 4 und den NRAS-Exons 2 und 3 auftreten (3).
Etwa 50% der Melanome weisen aktivierende Mutationen in BRAF auf. Über 90% der BRAF-Mutationen führen zu einem Nukleotid 1799 T> Eine Änderung, die zu einer Valin-zu-Glutaminsäure-Substitution an Position 600 (V600E) führt. Die BRAF-V600E-Mutation verursacht eine unkontrollierte Signalisierung des MAPK-Signalwegs, was zu übermäßigem Zellwachstum und -proliferation führt. Wirkstoffe, die auf aktivierte mutierte BRAF (BRAF-Inhibitoren) abzielen, haben sich bei Patienten mit metastasiertem Melanom, das diese Mutation aufweist, als erfolgreich erwiesen (1-3).
Abgesehen von ihrem prädiktiven Wert beim Melanom hat die BRAF-V600E-Mutation auch einen prognostischen Wert bei Darmkrebs und Lungenkrebs (NSCLC) (4,5,7). Die BRAF-V600E-Mutation tritt bei etwa 10% der metastasierten Kolorektalkarzinome auf und wurde mit dem Vorhandensein von Mikrosatelliteninstabilität in Verbindung gebracht (6). Insgesamt haben Patienten mit BRAF-mutiertem CRC niedrige Ansprechraten auf konventionelle Therapien und eine ungünstige Prognose. Während BRAF-V600-mutierte Melanome empfindlich auf BRAF-Inhibitoren reagieren, sind BRAF-V600-mutierte CRCs möglicherweise nicht so empfindlich. Die Aktivierung von EGFR bei Darmkrebs könnte erklären, warum Darmkrebs im Allgemeinen weniger auf BRAF-Inhibitoren anspricht. Daher wird empfohlen, eine Kombinationstherapie mit EGFR- und BRAF-Inhibitoren einzuleiten.
Die BRAF-V600E-Mutation tritt auch bei 3-5% aller Lungenkrebserkrankungen auf (7). Während sich BRAF-Inhibitoren bei V600E-mutationspositiven NSCLC-Patienten als erfolgreich erwiesen haben, hat die FDA die Verwendung der Kombinationstherapie mit BRAF- und MEK-Inhibitor für NSCLC-Patienten mit einer V600E-Mutation genehmigt, basierend auf den Ergebnissen einer internationalen, multizentrischen, drei Kohorten umfassenden, nicht randomisierten, nicht vergleichenden, offenen Studie bei Patienten mit lokal bestätigtem BRAF-V600E-mutationspositivem metastasiertem NSCLC.
Probenanforderungen
Akzeptable Proben für den Assay sind formalinfixierte, in Paraffin eingebettete kolorektale Karzinomgewebeproben mit einer Fixierungszeit von 6-48 Stunden.
Volumen
1 repräsentativer Paraffinblock ist bevorzugt. Alternativ sind für Resektionsproben mindestens 5 ungefärbte Gewebeschnitte (5 µm dick) erforderlich (vollständige RAS-Prüfung).
Lager- und Versandhinweise
Proben bei Umgebungstemperatur aufbewahren und versenden.
Einschränkungen
Unzureichender Tumorgehalt erlaubt möglicherweise nicht den Nachweis von KRAS / NRAS / BRAF-Mutationen: 10% der Tumorzellen sind erforderlich. Der Tumorinhalt wird vor der Analyse ausgewertet und eine Makrodissektion durchgeführt. Andere Fixiermittel als Formalin oder eine verlängerte Fixierzeit können zu unzureichenden Ergebnissen führen.
Besondere Anforderungen
Keine.
Turn-around-time
5 bis 7 Werktage für Objektträger und Paraffinblöcke.
- In: Li et al. Ein hochgradig verifizierter Assay zum Nachweis von KRAS-Mutationen in Gewebe und Plasma von Lungen-, Darm- und Bauchspeicheldrüsenkrebs. In: Arch Pathol Lab Med. 2019 Februar;143:183-9
- In: Patten et al. Ein empfindlicher und genauer Test zum gleichzeitigen Nachweis von 36 BRAF- und NRAS-Mutationen. Zeitschrift für klinische Onkologie 2018 36:15
- In: Douillard JY et al. Panitumumab-FOLFOX4-Behandlung und RAS-Mutationen bei Darmkrebs. In: N Engl J Med. 2013 September 12;369(11): 1023-34.
Aktualisiert am 03 Dezember 2019
