Kruppelähnlicher Faktor 2 (KLF2) reguliert die proinflammatorische Aktivierung von Monozyten

Ergebnisse

Die KLF2-Expression wird mit der Monozytenaktivierung / Differenzierung in Makrophagen reduziert.

Um die Rolle von KLF2 bei der Regulation von Immunzellen wie Monozyten / Makrophagen besser zu verstehen, untersuchten wir zunächst die Expression von KLF2 in primären humanen Monozyten. Wie in Fig. 1A Links ist die KLF2-Expression in primären humanen Monozyten robust und bei Differenzierung in Makrophagen nach 5 Tagen stark reduziert. Die KLF2-Expression in der humanen monozytären Zelllinie THP-1 war viel geringer als in primären humanen Monozyten. Die Expression wurde jedoch weiter reduziert, wenn diese Zellen mit LPS oder 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat behandelt wurden, zwei Substanzen, die gut etabliert sind, um zelluläre Aktivierung oder Differenzierung zu induzieren (Abb. 1A rechts).

Als nächstes wollten wir feststellen, ob die KLF2-Expression in vivo im entzündlichen Umfeld reguliert wird. Monozytäre Aktivierung ist ein Schlüssel pathophysiologisches Ereignis bei der Entwicklung von Atherosklerose, eine chronische low-Grade entzündliche Erkrankung, so begründeten wir, dass KLF2 Ausdruck kann bei diesen Patienten reduziert werden (11). Wir untersuchten eine Gruppe von 14 altersgerechten normalen Probanden und 14 Patienten mit ausgedehnter Atherosklerose (≈50% mit Revaskularisation der Koronararterien in der Vorgeschichte), die nach dem niedrigsten bzw. höchsten Finkel–Biskis–Jinkins-Osteosarkom-Gen (FOS) geschichtet sind, das nachweislich als Entzündungsmarker dient (12). Wie in Fig. 1B war die KLF2-Expression bei Patienten signifikant um ≈30% reduziert. Im Gegensatz dazu wurde kein signifikanter Effekt für KLF3, KLF6, KLF11 und KLF13 beobachtet. In Übereinstimmung mit unserer vorherigen Studie war die FOS-Expression bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit signifikant erhöht (12).

KLF2 hemmt die Monozytenaktivierung und die Phagozytenkapazität.

Als Reaktion auf Entzündungsreize exprimieren Monozyten erhöhte Spiegel an proinflammatorischen Faktoren und Zytokinen / Chemokinen und zeigen eine erhöhte Phagozytenkapazität. Um einen Einblick in die Rolle von KLF2 in der Monozytenfunktion zu erhalten, haben wir Überexpressionsstudien durchgeführt. THP-1-Zellen wurden entweder mit Control empty Virus (EV) oder KLF2 (Ad-KLF2) für 24-48 h infiziert und dann mit LPS für 2 und 6 h stimuliert. 2A führte die Behandlung von EV-infizierten Zellen mit LPS (25 ng / ml) zu einer robusten Induktion von Cyclooxygenase (COX) -2, Gewebefaktor und Monozyten-Chemoattraktionsprotein (MCP) -1 mRNA. Im Gegensatz dazu war diese Induktion in KLF2-infizierten Zellen deutlich abgeschwächt (Abb. 2A). Ähnliche Effekte wurden auch in der Maus-Monozyten-Zelllinie J774a beobachtet (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus hemmte die Überexpression von KLF2 die Sekretion verschiedener Zytokine und Chemokine stark. Wie in Fig. 2B, KLF2-Überexpression schwächte die LPS-vermittelte Induktion von Faktoren wie CD40L (um 49,6%), Makrophagen-Entzündungsprotein 1α (48,4%), Makrophagen-Entzündungsprotein 1β (64,2%), IL-1β (55,0%), IL-8 (79,1%), TNF-α (50,2%) und MCP-1 (68,8%). Dieser Effekt war spezifisch, da kein signifikanter Effekt auf die Spiegel mehrerer anderer relevanter Wachstumsfaktoren (TGFß1, Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor und Granulozyten- / Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor), Zytokine / Chemokine (IL-4, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-1α und IFN-γ) oder matrixverändernder Enzyme (Matrixmetalloproteinase-Typen 1, 2, 3 und 9) beobachtet wurde (Daten nicht gezeigt).

Ein klassisches Merkmal der aktivierten Monozyten / Makrophagen ist die Phagozytose. Um festzustellen, ob KLF2-Überexpression die phagozytische Fähigkeit von Monozyten beeinflusst, überexprimierten wir KLF2 oder Kontrolle (EV) in THP-1-Zellen, stimulierten mit LPS und bewerteten die Fähigkeit dieser Zellen, die rot markierten Zymosan-A-Biopartikel aufzunehmen. Wie in Fig. 2C gezeigt, nahmen kontrollvirusinfizierte Zellen die Zymosan-Biopartikel auf. Im Gegensatz dazu war die Aufnahme durch KLF2-exprimierende Monozyten deutlich reduziert (Abb. 2 C). Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass KLF2 die Monozytensekretion von Zytokinen / Chemokinen und die Phagozytose hemmen kann.

KLF2 hemmt die Monozytenrekrutierung nicht.

Als nächstes wollten wir die Wirkung von KLF2 auf die Monozytenfunktion in vivo bewerten. Als Reaktion auf eine Verletzung oder einen Entzündungsreiz werden Monozyten aus dem Blutkreislauf in Gewebe rekrutiert. Wir führten zunächst Studien durch, um zu beurteilen, ob die Monozytenrekrutierung durch die KLF2-Expression verändert wurde. Um den Beitrag anderer Zelltypen zu minimieren, verwendeten wir C.B-17-Scid-beige Mäuse, denen T-, B- und natürliche Killerzellen fehlen. Diese Tiere (n = 5 pro Gruppe) wurden dann einer Ganzkörperbestrahlung unterzogen und mittels Schwanzveneninjektion (beschrieben in Materialien und Methoden) mit J774a-Zellen rekonstituiert, die adenoviral entweder mit dem Kontrollvirus (EV) oder KLF2 infiziert waren. Die Tiere wurden dann einer IP-Injektion von Thioglykolat (einem starken chemischen Reizstoff, der die Rekrutierung von Monozyten induziert) unterzogen, und die Anzahl der GFP-positiven Zellen wurde 48 h später durch durchflusszytometrische Analyse beurteilt. Wie in Fig. 2 C und D hemmte KLF2 die Rekrutierung von GFP + J774a-Monozyten in die Peritonealhöhle nicht. Tatsächlich beobachteten wir reproduzierbar, dass KLF2-transduzierte Tiere einen signifikanten Anstieg der GFP + -Zellen aufwiesen. Diese Daten legen nahe, dass KLF2 die monozytäre Rekrutierung an einer Entzündungsstelle nicht hemmt, sondern verstärkt.

KLF2 hemmt Carrageen-induzierte Entzündungen.

Nach Rekrutierung und Migration in Gewebe sezernieren Monozyten Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren, um die Entzündungsreaktion aufrechtzuerhalten. Wie in Fig. 2B stellten wir fest, dass die KLF2-Überexpression die Entwicklung mehrerer Zytokine und Chemokine abschwächte. Um festzustellen, ob KLF2 die monozytäre proinflammatorische Funktion beeinflusst, verwendeten wir ein gut etabliertes Modell für Entzündungen: Carrageen-induzierte Fußpolsterinjektion. Es wurde bereits gezeigt, dass die Injektion dieser Chemikalie reproduzierbar eine Entzündungsreaktion hervorruft, die durch Pfotenödeme gekennzeichnet ist (13-15). C.B-17-Scid-beige Mäuse (n = 4 pro Gruppe) wurden wie oben beschrieben bestrahlt, mit Kontroll- oder KLF2-exprimierenden J774a-Zellen rekonstituiert und dann mit Carrageeninjektion in das Footpad in Frage gestellt (beschrieben in Materialien und Methoden). Das Volumen wurde mit einem für kleine Volumina modifizierten Hydroplethismometer (Ugo Basile, Mailand) bestimmt. Wie in Fig. 2 F zeigten EV-infizierte Tiere eine Zunahme des Pfotenvolumens um 17 ± 1,08 mm3 und 23,3 ± 3,05 mm3 nach 1 bzw. 2 h Carrageeninjektion. Im Gegensatz dazu zeigten Tiere, die mit KLF2-exprimierenden J774a-Zellen rekonstituiert wurden, nur eine Zunahme des Pfotenvolumens um 6,25 ± 0,85 mm3 und 7,5 ± 0,95 mm3 bei 1 bzw. 2 h nach Carrageeninjektion (Abb. 2 F). In Übereinstimmung mit diesem Bruttoeffekt ergab die histologische Analyse der Pfoten eine verringerte Flüssigkeitsextravasation, die zur Ödembildung führt (Abb. 2 G, Pfeile).

Wirkung von KLF2 Knockdown auf entzündliche Genexpression.

Um die Bedeutung von KLF2 für die Expression monozytischer Entzündungsgene zu bestimmen, wurden auch Small Interfering RNA (siRNA) -vermittelte Knockdown-Studien durchgeführt. Wie in Fig. 2 H führte im Vergleich zu unbehandelten (Kontroll-) und unspezifischen siRNA-behandelten Zellen ein Knockdown von KLF2 (≈60% Knockdown) in J774a-Zellen zu einer Induktion von Entzündungsgenen wie MCP-1 und einem bescheideneren Effekt auf COX-2 und Gewebefaktor Expressionsniveaus. Diese Ergebnisse wurden auch mit Real-Time PCR-Analyse verifiziert (Abb. 2 ICH).

KLF2 hemmt NF-kB- und AP-1-Promotoraktivitäten.

KLF2 kann die LPS-vermittelte Induktion von MCP-1, COX-2 und Gewebefaktor (Abb. 2A). Es ist bekannt, dass die Induktion dieser Ziele durch proinflammatorische Stimuli durch Transkriptionswege wie NF-kB und AP-1 reguliert wird. Wir folgerten, dass KLF2 im Prinzip diese Wege auf mehreren Ebenen wie Expression, DNA-Bindung oder Induktion von Transkriptionsaktivität hemmen kann.

Wir haben uns zunächst auf NF-kB konzentriert, da es eine zentrale Rolle bei Entzündungen spielt. Die Überexpression von KLF2 veränderte die nukleare Akkumulation von p65 oder die nuklearen Spiegel der IkB-Kinase (IKK) α und IKKy nicht (Abb. 3A). Darüber hinaus veränderte die KLF2-überexpression nicht die Kinetik der IkB-Phosphorylierung oder -degradation oder die zytoplasmatischen Spiegel von IKKa, IKKß und IKKy (Abb. 3B). In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen beeinflusste KLF2 die NF-kB-Bindung an DNA nicht. Wie in Fig. 3C, Behandlung von Kontrollvirus-infizierten Zellen (EV) mit LPS induzierte eine einzelne Hauptbande. Wettbewerbs- und Supershift-Studien bestätigten, dass diese Bande NF-κΒ darstellt. Ein nahezu identisches Muster der NF-kB-Bindung wurde in KLF2-überexprimierenden Zellen beobachtet. Um zu beurteilen, ob KLF2 die NF-kB-vermittelte Transkriptionsaktivierung beeinflussen kann, wurden Genreporter-Assays durchgeführt. Wie in Fig. 3D, Transfektion von p65 mit einem NF-kB-Luciferase-Reporterplasmid induzierte Transkriptionsaktivität um ≈das 11-fache. Diese Induktion war in Gegenwart von KLF2 stark reduziert, was darauf hindeutet, dass KLF2 die Transkriptionsaktivität von NF-kB hemmt. Ähnliche Effekte von KLF2 wurden für den AP-1-Signalweg beobachtet (Abb. 5 A-C, die als unterstützende Informationen auf der PNAS-Website veröffentlicht sind).

Rekrutierung des Coaktivators CBP-assoziierter Faktor (PCAF) durch KLF2 als vereinheitlichender Mechanismus.

Zusammengenommen ergeben sich die Ergebnisse in Fig. 3 zeigen, dass KLF2 die NF-kB-vermittelte Transaktivierung unabhängig von Effekten auf die DNA-Bindung dieser Faktoren hemmen kann. Ein möglicher Mechanismus ist die Rekrutierung kritischer Coaktivatoren. Beispielsweise erfordert eine optimale NF-kB-Bindung eine Interaktion mit mehreren wichtigen Coaktivatoren wie dem Steroidrezeptor-Coaktivator (SRC) -1, PCAF und p300 / CBP. KLF2 kann mit einem oder mehreren dieser Faktoren interagieren, sie von NF-kB entfernen und infolgedessen die NF-kB-vermittelte Transkriptionsaktivität verringern.

Um die Rolle von PCAF bei der KLF2-vermittelten Hemmung der NF-kB-Transkriptionsaktivität zu bestimmen, führten wir Kotransfektionsstudien mit exogenem PCAF durch. Transfektion von PCAF (aber nicht p300; daten nicht gezeigt) signifikant die KLF2-vermittelte Repression des NF-kB-Konkatemers (Abb. 4A). Ein teilweiser Effekt wurde auch auf die Fähigkeit von KLF2 beobachtet, die Transkriptionsaktivität von AP-1 zu hemmen (Abb. 5D). Um festzustellen, ob KLF2 und PCAF miteinander interagieren, führten wir GST-Pull-Down- und Coimmunpräzipitationstests durch. Unter Verwendung von in vitro transkribierten und translatierten Produkten fanden wir heraus, dass KLF2 und PCAF direkt in einem zellfreien System interagieren können (Abb. 4 B). Um zu wissen, ob PCAF in vivo an KLF2 bindet, überexprimierten wir KLF2 (Hämagglutinin-markiert) und PCAF (Flag-markiert) in COS-7-Zellen. Immunpräzipitation mit einem Anti-Flag-Antikörper gefolgt von Western-Blotting mit einem Anti-Hämagglutinin-Antikörper zeigte, dass KLF2 mit PCAF in Zellen bindet (Abb. 4 C).

Um festzustellen, ob die den beobachteten Effekten zugrunde liegenden Mechanismen in vivo wirksam sind, haben wir Chromatinimmunpräzipitationsstudien (ChIP) durchgeführt. Erwartungsgemäß führte die LPS-Stimulation von THP-1-Zellen zur Rekrutierung von p65 und PCAF an den COX-2-Promotor (Abb. 4 D). Zusätzlich wurde eine gleichzeitige Acetylierung von HH3 und HH4 beobachtet. Im Zusammenhang mit der KLF2-Überexpression sind jedoch sowohl die PCAF-Rekrutierung als auch die Histonacetylierung stark abgeschwächt (Abb. 4 D). In Übereinstimmung mit unseren Gel-Shift-Assays wurde kein signifikanter Effekt von KLF2 auf die p65-Rekrutierung beobachtet.